陳連旭 綜述 于長隆審閱
北京大學運動醫學研究所，北京100083
摘要：RNA干涉(RNA interference)是指由特定雙鏈RNA（dsRNA）引起的轉錄后基因沉默現象,是目前分子生物學、細胞生物學和遺傳學的研究熱點，為人們研究基因功能提供了一個有力工具。siRNA(small interference RNA)是RNAi的起始誘導物，在細胞內引起強烈的RNAi,降解目的基因的mRNA，以控制目的基因的表達。轉錄因子NF-kB是介導許多免疫和炎癥的中心物質 ，在介導骨性關節炎形成的許多細胞因子中，發揮關鍵的作用 。本文只在回顧近來在RNAi,NF-kB和骨性關節炎中細胞因子的研究進展，探討RNAi技術應用骨性關節炎的治療。
關鍵詞： siRNA；NF-kBp65；基因治療；骨性關節炎；細胞因子
一、RNAi技術
RNA是生物體內最重要的物質基礎之一，它與DNA和蛋白質一起構成了生命的框架。最近因其能干涉生物基因表達而頗受矚目，并且由此而引發的RNA干擾。RNAi(RNA interference)即RNA干擾，自從1998 年被闡明以來，一直是分子生物學、細胞生物學和遺傳學的研究熱點。從植物、真菌到線蟲乃至哺乳動物和人類，RNAi研究方興未艾。
RNAi的發現
早在10多年前，植物學家在研究轉基因植物時就發現，部分外源基因導入植物后，不但未能正常表達，植物自身的等位基因表達也受到抑制，即所謂共抑制（cosupression）現象。此后，在酵母菌和線蟲研究中也發現類似現象，稱之為緩解（quelling）。這種基因抑制是發生在轉
錄后水平的，因此又稱為轉錄后基因沉默(post-transcription gene silencing PTGS)[1]。Fire等［2］在利用反義RNA進行線蟲基因阻斷時，發現雙鏈RNA能夠引起mRNA降解，而且這一效應是基因特異性的。此后，越來越多研究證實，共抑制、緩解和轉錄后基因沉默，都存在由雙鏈RNA 介導mRNA降解的共同機制—-在生物體內，當外源性或內源性雙鏈RNA（double-stranded RNA dsRNA）進入細胞后，識別含有其互補序列的RNA并與之結合后，在酶的作用下降解mRNA，從而干擾相應基因表達。Fire將這一現象稱為RNA interference(RNAi)。這是一種廣泛存在于生物界的古老的現象，早在動植物分化之前的生物體內就已經產生了。RNAi在生物抵御病毒感染，維持基因組中轉座子的穩定以及某些生物生殖細胞的發育過程中都起著重要作用。
RNAi的分子機制
隨著研究的深入，科學家對于RNAi的發生機制已達成了初步共識：外源性（如病毒）或內源性的dsRNA在細胞內與一種RNA酶3（RNAase 3 endonucleasee）—Dicer結合，隨即被切割成21-23 nt的，帶有3’端單鏈尾巴及磷酸化的5’端的21-23 nt的短鏈dsRNA，是RNAi的起始誘導物，即siRNA（small interference RNA）。siRNA與Dicer形成RISC復合體（RNA induced silencing complex)。siRNA作為引導序列，按照堿基互補原則識別靶基因轉錄出的mRNA，并引導RISC復合體結mRNA。隨后siRNA與mRNA在復合體中換位，核酸酶Dicer將mRNA切割成21-23 nt的片段，特異性地抑制靶基因的表達。而新產生的雙鏈RNA片段可再次形成RISC復合體，繼續降解mRNA，從而產生級聯放大效應。因此，每個細胞只需要幾個siRNA分子就能夠引起強烈的RNAi效應[3]。此外，siRNA還可以在RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase RDRp）的作用下進行大量擴增，并轉運出細胞，使siRNA擴散到整個機體并可以傳代[4]。
RNAi作用機制示意圖：
RNAi與基因功能研究
人工誘導RNAi技術的建立，為人們提供了一種高效的基因功能研究方法。有人將綠色熒光蛋白基因（green fluorescent protein GFP）導入斑馬魚胚胎后，通過顯微注射將針對GFP序列的dsRNA注入細胞，結果GFP基因受到抑制，而同時轉入的其他基因不受影響。注入針對控制脊索或眼睛發育基因的dsRNA后，胚胎發育成無尾或無眼的斑馬魚。這說明在脊椎動物中，內源和外源性基因都可以被其同源的dsRNA特異性抑制，并產生基因缺失表型。Tuschl實驗組將體外構建的dsRNA分別導入Hela細胞（人類宮頸癌細胞）、大鼠成纖維細胞和小鼠3T3細胞，分別抑制了哺乳動物LaminB1,LaminB2,NUP153,GAS41,ARC21,cdk1,b-actin和r-actin，等21個不同類型基因，均獲得成功，并重新界定了部分必須基因和非必須基因[5]。RNAi抑制作用有嚴格的序列特異性，即使一個堿基的錯配，也會嚴重影響抑制效果。與傳統的基因功能的研究方法相比，RNAi技術靈敏、可靠、結果穩定，操作便捷，費用相對較低，很適合用于大規模篩選，定位新的功能基因。
哺乳動物細胞中的RNAi研究
RNAi技術已成為生物基因功能研究有力工具。然而在哺乳動物細胞中，超過30nt的dsRNA會啟動一種自身細胞毒機制，使大量mRNA非特異性降解，引起細胞死亡。為了克服這一障礙，Tuschl和他的同事將體外合成含有19個堿基對和2-3 nt的3’端單鏈尾巴的短鏈siRNA，通過脂質體轉染，導入哺乳動物細胞后，成功誘導RNAi。但是，在一些類型的細胞中，只能對靶基因產生瞬時抑制效應[6]。于是學者們構建了的以DNA為模板的siRNA表達載體。將19nt的目的序列及其反向重復序列插入含有啟動子質粒染色體，同時插入作為檢測標志的報告基因（reportor）如GFP。該表達載體轉染細胞后，能夠轉錄出含有19個堿基對的莖環狀（發夾狀）siRNA,誘導RNAi，有效抑制目的基因[7]。表達載體的方法將合成siRNA的過程轉移至細胞內進行，不但效率大大提高，而且可以排除RNA酶的干擾，延長siRNA的半衰期[8]。更重要的，隨著載體質粒的復制、擴增，siRNA擴散到整個機體，基因抑制效果能夠傳代。這一方法的應用，使siRNA技術應用，進入了新階段。
siRNA與基因治療
與基因替代、反義寡核苷酸治療、細胞因子基因治療等傳統的基因治療方法相比，siRNA技術有著無可比擬的優勢。首先，RNAi基因抑制效果確切。微量的siRNA即可使其編碼致病基因產物的含量下降90%以上，達到剔除（knock-out）的效果。其次，RNAi抑制具有嚴格的序列特異性，治療的針對性強，副作用小。在抗病毒研究中，Lee等[9]在HVI-1病毒基因組的rev和tat基因中分別選取21nt的序列為靶點，進行RNAi抑制，5d后檢測HVI-1的p24抗原下降達90%，細胞的生長未受影響。針對脊髓灰質炎病毒和丙型肝炎病毒的體外RNAi抑制實驗，也可以顯著降低培養人類細胞中的病毒滴度。美國冷泉港實驗室的McCaffray AP 研究組，第一次在活體大鼠體內成功誘導了RNAi，使其肝臟內的HCV含量平均下降81%[10]。腫瘤是多基因、多因素疾病，單個癌基因的抑制往往很難達到治療效果。RNAI技術能夠同時抑制多個不同基因,而且抑制效果互不干擾。此外，RNAi識別可以精確到一個核苷酸，對由野生型點突變形成的癌基因，如ras，p53等，能夠產生準確有效的封閉效果，野生型基因則不受影響。實驗證明，bcl-2，CDK-2，PLK-1,p53等腫瘤相關基因的RNAi抑制，能夠使人類宮頸癌細胞（hela）增殖速度減慢，惡性程度降低，凋亡加快。肝癌（Hep3B）、非小細胞肺癌（HI299）、頭頸部鱗狀細胞癌（C33-A）、骨肉瘤（U-2OS）及前列腺癌（LNCaP）[11]、白血病[12]等細胞系中的實驗也發現類似效應。此外，將RNAi應用于wils0on病等先天遺傳性疾病的體外實驗也獲得令人滿意的結果[13]。H.W.Zhou等[14]利用siRNA技術在骨性關節炎的軟骨細胞抑制p16基因，獲得滿意效果，這也是首次在軟骨細胞中應用RNAi技術，提示我們可以在骨科領域應用RNAi技術。
二、核因子kappaB
核因子kB(nuclear factor kappaB,NF-kB)是1986年由Sen和Baltimore首次從B淋巴細胞中監測到的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因增強子kB序列特異結合的核蛋白因子[1]。NF-kB是普遍存在于真核細胞中的一種快反應轉錄因子，在靜息狀態下與抑制性蛋白IkB結合并以非活性狀態存在于胞漿內。抑制狀態的NF-kB對環境變化比較敏感，可被多種刺激激活，轉入核內調節一系列基因的表達。NF-kB對大量基因的調節，在機體的正常生理狀態和各種疾病的病理發生機制都發揮著重要的作用。它不僅參與機體正常的免疫和炎癥反應、發育、細胞的生長和調亡過程，同時它與癌癥、關節炎、哮喘、心血管疾病也有密切的聯系。
NF-kB的結構
NF-κb是屬于Rel家族的二聚體蛋白，具有300核苷酸的同源結構域：Rel同源結構域(Rel Homology Domain,RHA)，內含DNA結合域、二聚化結構域和核定位信號（nuclear translocation signal,NLS）區，分別具有與DNA上的kB序列結合，與同源或異源亞基形成二聚體，與NF-kB抑制蛋白IkB家族成員相互結合等功能。大多數二聚體包括P65（Rel A）和P50兩種蛋白，其他Rel家族的蛋白如：c-ReL,Rel B、v-Rel、P52也有可能以不同的方式跟它結合。不同形式的二聚體可能選擇激活不同的基因，具有不同的轉錄活性。RelA、RelB和c-Rel的C端含有轉錄激活域（transactivation domain）,其中富集絲氨酸、酸性氨基酸和疏水性氨基酸，能直接作用與轉錄元件而激活轉錄過程，而p50和p52無此結構。NF-kB/Rel蛋白家族均以同源或異源二聚體形式存在，其中以p50/RelA最普遍，幾乎存在于所有的細胞中。p50亞基用于與DNAkB序列結合，而RelA亞基即可利用其C端的轉錄激活域增強靶基因的轉錄激活，又可與各種Ikb成員直接藕聯[2]。
IkB抑制蛋白家族包括IkBa、IkBb、IkBr、IkBe、p100、p102、Bcl-3和IkB-R[3]。其中IkBa和IkBb時NF-κB活性的主要調節者。它們享有三個共同的結構特征：都有一個N末端調節域，與信號誘導的IκB蛋白降解有關；都有6個獲7個錨定蛋白重復區，可與RHD結合而隱藏NF-kB的NLS,從而阻止NF-κB的核移位；IκB的C端富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的羧基末端片斷（PEST）基序，該基序在抑制NF-κB與DNA的結合中發揮作用。
NF-κb正常情況下跟阻滯蛋白IκB結合，以非活性方式存在與細胞質中，IκB分子具有ankryn樣的重復序列，同不同的Rel蛋白結合，覆蓋核轉錄信號位點。當有外源激活信號時，通過一系列酶的作用,IκB磷酸化，脫離多聚體，而使NF-κB暴露轉錄位點而進入核內，結合到Rel蛋白的順式作用結合位點（GGGRNNYYCC），發揮轉錄因子的作用,促進基因的轉錄[4]。轉錄結束后，NF-kB與新合成的IκB結合出核并再次失活。外源激活刺激包括：前炎細胞因子（IL-1β,TNF-α,IL-11,IL-17）、脂多糖，蛋白激酶C、氧化劑、各種病毒及某些理化因素等。NF-κB激活后，快速誘導包括免疫反應和炎癥反應在內的多基因表達,主要包括細胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-11、IL-17)，化學因子（IL-8等）,炎性酶（iNOs和iCOX-2）、黏附因子（ICAM-1,VCAM-1），生長因子(VEGF)，凋亡相關因子p53和某些受體。既然NF-kB可以調節IL-1β和TNF-α表達，也可被它轉錄激活，在某些細胞中隨著NF-κB的慢性激活，可導致前饋性擴增。NF-κB不只是單獨作用，而是跟其他轉錄因子如：AP-1、ATF和C/EBP共同作用，擴大基因表達。
靶向性破壞NF-κB的組成元件，在其轉錄過程中發揮重要作用，敲除RelA的大鼠不能存活，敲除p50的基因導致對感染的易感，破壞IkB導致延長NF-κB的激活、感染的刺激，動物由于廣泛感染而死亡。如果抑制NF-κB的活動，可以減輕免疫反應和炎性介質的釋放，激素、阿司匹林和金制劑都是它的抑制劑，已廣泛應用于臨床。拮抗p65的反義寡核苷酸已用于試驗和臨床研究中。它能抑制大多數炎細胞因子的表達，減輕炎癥反應，減輕組織破壞。
三、骨性關節炎的細胞因子學說
近年來的研究表明，細胞因子和多肽生長因子不僅在關節軟骨和滑膜的正常結構和功能的維持方面起重要作用，而且，一些因子在關節炎的病理過程中對關節軟骨和關節滑膜也具有一定的破壞作用。在OA發生中最引人注目的是IL-1β、TNF-α兩種細胞因子，IL-1β 和TNF-α是關節炎病理過程中促進軟骨機制降解和關節軟骨破壞的兩種最重要的細胞因子。大量證據表明，IL-1b在關節炎的病理生理過程中發揮重要的作用，通過一系列反應，導致關節炎癥和軟骨的破壞[1、2]。在關節軟骨中，IL-1可阻止軟骨基質蛋白的形成 [3、4]，誘導軟骨細胞產生基質金屬蛋白酶[5]，介導金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）與金屬蛋白酶（MMPs）之間失衡，降解軟骨基質成分。還可誘導產生炎性介質，包括前列腺素（PGE）[6]和一氧化氮(NO)[7],導致關節的腫脹和疼痛。由誘導性一氧化氮合酶（iNOS）產生的一氧化氮(NO)在關節炎疾病的病理生理過程中發揮重要的作用。而阻止一氧化氮的合成，可抑制一些關節炎的發生[8、9]。在關節中，NO主要有軟骨細胞和滑膜細胞產生[10]，對IL-1β和TNF-α等刺激敏感，這些刺激主要加快iNOS的表達和合成，以增加NO的產量[12、13]，iNOS蛋白的合成調節主要在轉錄水平，主要包括NF-kB和AP-1[13-18]。但A. Ferreira Mendes等[19]認為，NF-κB和p38是主要的兩條相互獨立的誘導iNOS表達的轉錄通路，阻止其中的任何一條，都足以阻止iNOS的表達，減少關節軟骨細胞內NO的含量。而前列腺素的增加與COX-2活化有關，主要與NF-κB調節有關，而干擾其活性可顯著降低COX-2的表達，進一步降低前列腺素的合成[20]。在軟骨組織中，TNF-α選擇性地抑制Ⅱ型和Ⅸ型軟骨膠原的產生，抑制蛋白多糖的合成，同時促其降解，另外，對PA、PGE2、和IL-6均有誘導作用，與OA軟骨破壞及滑膜炎有關。OA軟骨與正常軟骨相比，產生更多的TNF-α和TNF-α轉換酶（TNF-alpha convertase enzyme，TACE）mRNA，TACE是TNF-α的活性調節劑。從OA關節軟骨中分離的軟骨細胞中p55 TNF 受體(TNF-R)高表達。在神經細胞中，抑制NF-κBp50可抑制p53和NO的表達，可抑制神經細胞的凋亡。有作者認為，TNF-α是IL-1β的上游因子，可誘導IL-1β的產生并共同作用，在骨性關節炎的早期發揮作用。
小結
骨性關節炎的主要致病因素使IL-1β和TNF-α,二者都可通過NF-κB轉錄因子介導的通路激活MMPs,iNOS和COX-2,引起軟骨損傷和關節炎癥狀。而且還進一步反饋增加IL-1β和TNF-α的轉錄表達。因此應用特異性的siRNA阻抑p65蛋白的表達，從而降低NF-κB的轉錄表達活性，抑制上述炎性介質的表達，達到治療骨性關節炎的目的。同時在軟骨細胞中對NF-kB與p53的凋亡作用也進行初步的研究，為下一步的工作創造條件。
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