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http://bitebo.com/plus/list.php?tid=79 閃膠技術(shù)專題：說到電泳凝膠的片斷回收，想來在實驗室久已的“老手”們都會不屑一顧。確實，一般在各個和分子生物學沾到一點邊兒的實驗室里，從瓊脂糖凝膠中回收DNA，僅僅是一種簡單不過的常規(guī)實驗操作。雖說早期的凝膠電泳片斷回收沒有1—2個小時是搞不定的，每個實驗室也有自己的獨門秘訣，可后來各大品牌紛紛推出了了多種不同用途，不同價錢的快速凝膠回收試劑盒，一下子將膠回收的時間縮短到10多分鐘，操作也大大簡化，膠回收就變成“小菜一碟”了。
然而，從bbs逛上一圈下來，發(fā)現(xiàn)實際上還是有不少人為膠回收這種看似簡單的操作而煩惱。到底是什么導致了實驗新手，甚至是老手在這個已經(jīng)發(fā)展近40年的常規(guī)性實驗中卡殼？由于膠回收的質(zhì)量和數(shù)量直接影響后繼的一系列實驗——比如酶切連接、轉(zhuǎn)化篩選、測序或者PCR擴增、標記乃至顯微注射等等，生物通編者為大家搜羅各種產(chǎn)品和方法的優(yōu)缺點，注意事項，做一個膠回收全攻略篇。
一、膠回收的關(guān)鍵參數(shù)
膠回收的質(zhì)量直接影響后繼實驗的成功與否。要想做好膠回收，無論是自己親力親為還是借助目前五花八門的膠回收試劑，最基本的評定標準無外乎這么幾個:質(zhì)量（ 回收產(chǎn)物的純度和濃度），回收效率，操作方便（速度），柱子的載量等等。
回收產(chǎn)物質(zhì)量：回收產(chǎn)物的質(zhì)量主要指純度。常規(guī)電泳過程中，普通級別的瓊脂糖自帶的一些性狀不明的多糖，會連同DNA一起從凝膠中抽提出來，會強烈抑制后繼的連接、酶切、或者標記、擴增等實驗。從凝膠中回收DNA片斷，產(chǎn)物的純度自然是我們考慮的第一要務。對于大片斷DNA回收，質(zhì)量還包括了產(chǎn)物的完整與否，如果機械剪切力使得回收產(chǎn)物大小不一致，后果決不是你希望碰見的。而對于較小片斷回收，質(zhì)量其實還包括了回收產(chǎn)物的濃度。因為產(chǎn)物濃度太小，對后繼實驗同樣也有影響，比如連接、標記實驗等等就很不爽，往往不得不再濃縮一次，增加了操作的復雜性。此外，極微量的純化介質(zhì)或者是某些試劑混入回收產(chǎn)物中也會對結(jié)果產(chǎn)生致命的影響。
回收率：回收得率，是我們考慮的另一個重要參數(shù)。由于上電泳的樣品量通常都很少，電泳的過程本身也會導致樣品的分散和損失，因而盡可能多的回收電泳凝膠條帶中的目的片斷，提高產(chǎn)物得率，對于后繼實驗來說是非常重要的。回收率的多少通常和回收產(chǎn)物的大小以及量的多少有關(guān)，比如DNA片斷越大，和固相基質(zhì)的結(jié)合力越強，就越難洗脫，回收率就低；又比如說，DNA的量越少，相對損失越大，回收率越低。因此，根據(jù)情況選擇不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于樣品的大小和多少對回收率都有顯著的影響，所以回收率并非是一成不變的。
其他：操作方面，相信大家都會比較喜歡操作簡單，快速，應用起來方便的方法或者產(chǎn)品。比如溶膠的緩沖液中添加指示劑，可以指示溶膠的溶液pH值就是很方便的設計；離心過柱就比離心沉淀要簡單方便。載量，就是每次回收最多能回收的產(chǎn)物的量。這個自然是越大越好了，因為對于純化柱或者一定量的純化介質(zhì)，過量的產(chǎn)物吸附不了就是被浪費掉的。難免有時你需要回收比較大量的產(chǎn)物，大載量就很有優(yōu)勢——同一個片斷你要用2個柱子，多郁悶啊。(轉(zhuǎn)下頁)
二：膠回收方法和分類
20世紀70年代是一個奠定現(xiàn)代分子生物學的時代，1973年冷泉港實驗室的Joseph Sambrook和Phillip Sharp發(fā)明了利用瓊脂糖凝膠分離DNA和EB染料觀測DNA相結(jié)合的技術(shù)。現(xiàn)在，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、鑒定和純化核酸和蛋白質(zhì)片斷的標準方法。生物通將在后面另文討論聚丙烯酰胺凝膠電泳片斷回收的方法，這里首先介紹的是瓊脂糖凝膠電泳片斷回收的常用方法：
1.柱回收試劑盒：可謂目前最簡單快速的回收方法，只需要將電泳凝膠中的產(chǎn)物條帶切下，用溶解Buffer徹底溶解，上包埋有純化填料的純化柱，離心，再洗滌一次，離心后用洗脫緩沖液洗脫。全程不過10多分鐘，得到的產(chǎn)物溶液可以直接用于后繼實驗。這個方法幾乎不需要什么技巧就能得到穩(wěn)定的結(jié)果，也是目前最多商品化試劑盒選擇的方法。但是這個方法不適合用于大片斷的回收。
2.玻璃奶/純化填料膠回收試劑盒：這個方法比前面的方法更為靈活，可以根據(jù)每次回收實驗時預期回收量來調(diào)整純化填料的量，使得實驗不受限于柱子的載量，也不會造成浪費。前面的操作步驟和上者一樣，將電泳凝膠的條帶切下，Buffer溶解，（區(qū)別在于這里）加入純化填料填料吸附混合，快速離心沉淀去上清，洗滌沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脫液純化介質(zhì)中吸附的片斷釋放出來，離心，取上清，就是回收的產(chǎn)物。這個方法適合各種不同大小的片斷，特別是大片斷的回收，但是操作就較前者復雜一些，涉及到多次離心沉淀和取上清，有可能會誤吸了微量的沉淀；另外干燥的程度也有點技巧，干過了不好洗脫，沒干透又影響結(jié)果。后來的改進版本有將混合了純化介質(zhì)后的凝膠溶解液加入到一種離心過濾柱上，這種柱子不帶純化填料，只有一層過濾膜，離心過濾后，填料在柱子里，溶液被甩掉，這樣就避免了上述的問題。
3.低熔點瓊脂糖：傳統(tǒng)手工操作方法之一，低熔點瓊脂糖制備凝膠，電泳后切割目的條帶，在TE溶液中65度保溫融化，用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。這個方法需要用到酚氯仿等有機試劑，由于乙醇沉淀需時較長，現(xiàn)在用的人已經(jīng)不多了。想當年經(jīng)費緊張的時候，低熔點瓊脂糖貴，不舍得這么浪費的，比較取巧省錢的法子就是常規(guī)瓊脂糖電泳后，在目的條帶前方挖槽，灌入低熔點瓊脂糖，凝膠后再電泳一小會兒，等條帶進入低熔點瓊脂糖區(qū)域再將那塊家伙切出來，就可以非常非常節(jié)約了。除了直接酚抽低熔點瓊脂糖凝膠，還有人用瓊脂糖酶來消化瓊脂糖凝膠，條件也相當溫和，只是那酶價格并不便宜（光那酶的成本就至少5-6塊，還不算其他的麻煩事），多數(shù)的酶只適合用低熔點瓊脂糖，問題是我不用酶也可以直接酚抽，費時間還特長，所以，并不覺得特別好用。后來據(jù)說T家的瓊脂糖酶可以用于常規(guī)瓊脂糖，前提是你有辦法在65度把那膠化了。但那需要極好的耐心。我們后面會有介紹。
后來有老師從美國回來了，才有機會嘗試更好的低熔點瓊脂糖——FMC（現(xiàn)在叫做Cambrex了）的GTG級別低熔點瓊脂糖！那才是最簡單的方法呀！洗的超級干凈的電泳槽灌膠，電泳后，直接將條帶切下65度保溫融化，就可以直接在融化的瓊脂糖—DNA混合物中加酶進行后繼實驗——所謂的GTG就是遺傳技術(shù)級，可以在凝膠中進行各種酶反應的哦！實驗條件非常溫和，非常適合大片斷的回收。
4.透析帶電洗脫法。煩，簡直不堪回首。切下的條帶放在充滿TAE的透析帶中再電泳一段時間，讓DNA走出凝膠，走向溶液中，再反向電泳一會兒，將附在透析帶上的DNA趕回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后傳統(tǒng)方法酚抽沉淀，那塊膠通常還要再染色看看殘留。由于綁透析帶非常難搞，只有在萬不得已的非常大的片斷時才會考慮的。也是丙烯酰胺電泳凝膠產(chǎn)物回收的方法之一。
后來看到以色列的一個小公司GeBA有出簡易透析管（生物通早在02年就有新技術(shù)專欄文章介紹的），就是將小指管兩邊各開一小窗，貼上透析膜，把膠塊放在管中再電泳。由于不需要綁透析帶，使用方便；而且管中溶液體積小，容易處理；膜的面積也小吸附也少；頓時覺得是救星。后來貌似Pierce也推出了類似的東西，買起來更方便一點。
5.DEAE纖維素膜紙片法和其他改良法。早期實驗室最常用方法之一。將DEAE纖維素膜裁成小條活化處理。電泳后在目的條帶前切一刀，將比條帶略寬的DEAE纖維素膜插入切口，不留氣泡，繼續(xù)電泳一會兒，條帶上的DNA被膜片截留，取出膜片沖洗后轉(zhuǎn)移到離心管中加緩沖液65度保溫洗脫，直到膜上沒有DNA了，將溶液用酚氯仿抽提沉淀。這個方法不適合做較大的DNA，因為洗脫比較困難。
曾經(jīng)常用的另一方法是在電泳膠前挖小槽，加入緩沖液，電泳一小會兒，手提紫外監(jiān)視，等條帶進入槽中，還沒在另一頭上岸時停止電泳，吸出溶液酚氯仿抽提（加點甘油可降低DNA在溶液中的移動速度，防止那邊還沒全部下水，這邊就已經(jīng)上岸了的情況。當然也可以挖大點的孔或者多吸幾次，反正是要沉淀的，體積大些不要緊）。不過這些方法在柱回收試劑盒推出后都漸漸要淘汰了。畢竟比較麻煩費時間，而且回收的產(chǎn)物純度也不比試劑盒——前者是純化介質(zhì)吸附DNA后徹底除去溶液，經(jīng)過洗滌殘留在純化介質(zhì)上的雜質(zhì)，最后洗脫；手工的方法多是用酚氯仿抽提溶液后乙醇沉淀，由于有些多糖沉淀屬性和DNA相似時就容易共沉淀下來。鑒于競爭的日趨激烈,純化試劑價格逐漸向下,連核酸純化領(lǐng)域的頂級名牌Qiagen也開始大幅度的折扣優(yōu)惠,所以,有條件還是選擇試劑盒,比自己慢慢摸索要更能節(jié)約寶貴的青春。
所以，生物通在這里準備將回收片斷按照大小不同來分別介紹不同用途的產(chǎn)品：
常規(guī)片斷級（DNA片段為100bp-10kb）：主流方法是柱回收試劑盒 大片段級（DNA片段>7kb）：可選方法是玻璃奶/純化填料膠回收試劑盒，電洗脫 小片段級（DNA片段<100bp）：柱回收試劑盒(轉(zhuǎn)下頁) 三、常規(guī)片斷級的選擇指南：所謂常規(guī)級，即回收片段大小介于100bp和10kb之間，在這個范疇內(nèi)包含了一般的質(zhì)粒或者克隆片段的回收。主流方法是柱回收試劑盒。
1. Qiaquick Gel Extraction Kit
品牌：Qiagen
回收范圍：70bp-10kb 推薦指數(shù)： 價格指數(shù)：（50包裝1,350，250包裝6,372，約27元/反應，現(xiàn)有半價活動，價格非常可親！） 特點：
使用心得：
Qiaquick最引以為傲的就是非常穩(wěn)定的質(zhì)量，高回收率和方便的步驟。產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定可靠，一向是實驗首要條件。畢竟，實驗步驟是環(huán)環(huán)相扣的，每一步出現(xiàn)問題都會導致后患無窮，費時費力，還更費錢，對心情更是一種折磨。用試劑盒不就圖省事和可靠嗎？從核酸純化領(lǐng)域起步的Qiagen，在全球?qū)嶒炇叶枷碛袠O好的口碑，是值得信賴的選擇。因為Qiagen有強大的研發(fā)隊伍，精益求精優(yōu)化實驗操作的每一環(huán)節(jié)，絕非普通臨摹制品、仿制品可比。以回收率為例，我們前面提到，由于樣品的大小和多少對回收率都有顯著的影響，所以回收率并非是一成不變的。所以Qiagen以嚴謹?shù)膽B(tài)度提供多種條件下的詳細介紹：
記得《分子克隆II》里曾經(jīng)說少于500ng的DNA幾乎沒有回收價值，看看上表就可以發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在的技術(shù)發(fā)展，即使是少到100ng的DNA還有70%的回收率呢！而且操作方法還很簡單。
雖然是幾乎不需要實驗技巧的簡單操作，如果你注意到一些小技巧還是很有幫助的。DNA回收純度取決于純化介質(zhì)對DNA吸附的特異性、洗滌雜質(zhì)是否徹底。而DNA回收率和濃度則與elution buffer的體積，以及buffer在柱子上停留的時間有關(guān)。較大的洗脫體積可以提高回收率，充分洗脫，但是會造成產(chǎn)物濃度太低不好用。比如100-200ul的洗脫液可以徹底洗脫純化柱吸附的DNA，不過考慮到后繼實驗的方便，Qiaquick建議使用50ul的洗滌液，正對加入膜中央（避免加在管壁上而不能充分接觸純化介質(zhì)），可以完全浸潤回收柱上的純化膜。最低建議采用30ul洗脫液，但是可能會降低回收率。有人試過用15—25ul洗脫2次，覺得這樣第一次濃度高第二次比較充分，其實沒有必要，只要適當延長在柱上停留的時間，就有助于提高得率——Qiagen的Protocol說明，30ul停留1分鐘要比50ul停留1分鐘回收濃度高1.7倍。充分離心（保證速度和時間）有助于提高得率和純度，減少殘留對后繼實驗的影響（這個方法要注意不是所有試劑盒都可以使用，因為有些試劑盒的純化柱填料松一些，離心有時可能導致少量填料脫落，而Qiagen的這個產(chǎn)品是膜式的，結(jié)合非常牢固，據(jù)生物通線報，中大有人用這個柱子高溫消毒后重復使用，效果不賴，可見皮實。當然這是廠家絕對不推薦的）。
其他的技巧也是大家熟知的，比如切膠的時候要盡量減少切膠體積（不超過400mg），由于Qiaquick柱子的載量達到10ug，如果膠塊實在太大而預期DNA總量不超過10ug，可以用大一點的管溶解，分幾次上柱離心吸附后再洗滌。注意的是紫外照射時間不要太長，因為紫外線對DNA（特別是對于較大的片段）有影響。還有就是溶膠要徹底，用槍頭把膠塊弄碎一點有助于50度下快速溶解。溶解完全后溶液的顏色指示溶液的pH值，如果變色需要調(diào)pH值以防止實驗失敗。需要用ddH2O或者TE洗脫的，注意pH在7.0—8.5之間的回收率最高。回收率和片斷大小、多少有關(guān)，較大的片斷（7kb以上）回收率會有所降低，洗脫液預熱到50度再加入純化柱膜中央，有助于提高產(chǎn)率。
除了比較適合個人使用的傳統(tǒng)離心式，Qiagen還提供抽濾式的膠回收試劑盒，用抽濾的方法替代離心，使得實驗可以連續(xù)進行，特別適合批量進行的需要——想象看，你只要將溶膠液加入裝配好的抽濾管中，嘩一下就抽干了，再加洗滌的試劑，嘩一下又好了，多快呀！節(jié)約很多時間和功夫，不需要在離心機前面拿進拿出。以后的全自動操作模式就是這樣的啦！
看到這里可能大家都會說Qiagen的東西好是好，但是就是貴，一般的實驗室都舍不得平時用，往往留著關(guān)鍵時刻做，不錯，好東西自然不便宜，不過想要吃到便宜的午餐也不是不可能，目前生物通正在進行“看新聞，獲Qiagen優(yōu)惠券的活動，半價只要實付600多就可以買到，實在劃算，抓緊時機，趕快行動吧。（轉(zhuǎn)下頁）”
2.MinElute Gel Extraction Kit
品牌：Qiagen
回收范圍：70bp-4kb 推薦指數(shù)： 價格指數(shù)：（50包裝1,485，約29元/反應，現(xiàn)生物通有半價活動哦） 特點：
使用心得：
如果要回收片斷量本來就很少，比如只有幾十個ng，用常規(guī)的試劑盒洗脫得到將近50ul的產(chǎn)物，連接反應就很難做——要不體積很大，要不會覺得濃度太低。如果是用來做顯微注射、標記等實驗就更難受，只能再濃縮一次，不但麻煩，多一次操作也會導致產(chǎn)物進一步的損耗。這一點，就是快速的柱回收試劑盒比傳統(tǒng)方法不如的地方，因為傳統(tǒng)方法得到沉淀后可以按照需要溶解得到自己需要的濃度，柱回收就不行。MinElute就是為這個需要而誕生的。MinElute膠回收試劑盒是基于一種特殊的Silica gel menbrane的膜技術(shù)，能在高鹽濃度的條件下迅速吸附DNA，在低鹽或者純水條件下釋放DNA，只要短短幾分鐘，就能徹底除去包括引物、核苷酸、酶、礦物油、鹽、瓊脂糖、EB以及其它雜質(zhì)，和以前QIAGEN的Silica gel menbrane有所不同的是，它要求的洗脫體積非常小，只要10ul（當然這更要注意讓洗脫液加在膜上），純化的DNA是高度濃縮的，回收率在80%以上。這樣就非常適合用于后繼實驗操作，不需要再濃縮一次。
MinElute為了確保高質(zhì)量和高回收率，利用了特殊的binding buffer，這種緩沖液是特別設計和優(yōu)化了的，可以增加DNA分子特異性吸收，減少雜質(zhì)，不過也帶來了一個問題，那就是導致MinElute的DNA吸附范圍是70bp到4kb，而不是以往的10kb，因此4kb以上的只能用Qiagen的Qiaquick或其它產(chǎn)品了，而10kb以上就該用QIAEX II系列。此外MinElute柱子的載量是5ug，畢竟洗脫體積這么小。
體積小則小矣，可是質(zhì)量并不含糊，回收的產(chǎn)物可以用于PCR、克隆、標記、測序、體外轉(zhuǎn)錄等后繼實驗，也同樣可以用于顯微注射、芯片分析等要求非常嚴格的實驗。你盡管可以說，我又不需要做那些嚴格實驗，我就克隆PCR什么的就夠了，哪兒要那么純——然而你也不能否認這本來就是一種質(zhì)量可靠的信心保證。特別是當遇到特價活動的時候，你還猶豫什么呢。
除了以上幾個方面，MinElute系列產(chǎn)品正如Qiagen其它產(chǎn)品一樣：講究精確完美，注重細節(jié)品質(zhì)。MinElute有三種上樣Buffer染料顏色（青、藍和黃），方便樣品分析，并且也包含pH目測指示染料，可以在溶膠的時候幫助指示實驗錯誤（pH值對膠回收影響較大，見下）——錯誤的顏色代表了凝膠Buffer重復使用等實驗配置不當導致的不正確化合物，這種情況可通過醋酸鈉進行調(diào)整。（轉(zhuǎn)下頁）
3. Promega Wizard SV Gel and PCR Clean-up System
品牌：Promega
回收范圍：100bp-10kb 推薦指數(shù)： 價格指數(shù)： （50次包裝的試劑盒報價為562元，11元/次，折扣前）
Promega的產(chǎn)品在進口品牌中一向以價格可親而著稱。這個膠回收試劑盒也不例外。并且生物通編輯部還驚喜的發(fā)現(xiàn)這個試劑盒的性能參數(shù)好得令人刮目相看！首先是100bp—10kb的回收率高達80%—95%（用于PCR產(chǎn)物回收時適用于100bp—3.2kb的片斷）；然后是每個柱子的載量高達40ug！低至10ng。可以容納更多的DNA，滿足一次大量片斷回收的需求。另外，試劑盒推薦的洗脫體積是50ul，但是如果需要濃度高的回收產(chǎn)物，也可以用不少于15ul的純水洗脫，而且回收率也不會有太大的影響。回收產(chǎn)物可用于測序、克隆、標記、酶切、體外轉(zhuǎn)錄和芯片分析等后繼實驗。操作也同樣非常簡單，無非是溶膠吸附、洗滌柱子，最后洗脫。這樣，一個試劑盒兼具了多種優(yōu)點，加上價格相宜，實在是進口產(chǎn)品中的性價比之王。特別是大到9kb的片斷，回收率可以達到95%是難得的。
這個試劑盒使用中值得注意的幾個小技巧，比如如果凝膠體積大于350mg，可以分次離心（一個柱子最多可以過相當于3.5g凝膠！就是吸附10次！），而且離心前要讓溶膠液在柱子上靜置1分鐘讓其充分吸附。對于超過5kb的片斷，溶膠的時候不要振蕩，膠較濃的時候溶膠時間要延長保證充分溶解。洗滌2次有助于得到更干凈的產(chǎn)物。
4、Montage Gel Extraction Kit
品牌：Millipore
回收范圍：100bp-10kb 推薦指數(shù)： 價格指數(shù)： 特點：
使用心得：
這一款膠回收試劑盒不同于之前提到的凝膠回收方法——Montage利用的是從凝膠中抽取（compression）DNA片段的方法：通過離心力解離凝膠的結(jié)構(gòu)，驅(qū)使瓊脂糖在gel nebulizer中穿過小孔，這樣形成的膠泥就被甩進樣品過濾蓋中。因此無需其它多余的操作，直接將切下來的凝膠放進去，經(jīng)過5000g/10min，即可得到回收DNA片段（見下）。
回收率見下：
Millipore先進的膜技術(shù)使得Millipore純化系列其實在自動化高通量領(lǐng)域有相當好的口碑，價格實惠質(zhì)量可靠。
4.經(jīng)濟實惠的國產(chǎn)之選
在普通級膠回收中應該提及的是一些國產(chǎn)品牌，畢竟在現(xiàn)今膠回收技術(shù)成熟并得到了廣泛應用的基礎上，一些國產(chǎn)品牌也提供了經(jīng)濟實惠的膠回收試劑盒，比如天根，杭州維特潔，深圳天地人，等等。低廉的價格，使得平時用起來也揮灑自如不心疼，如果說進口產(chǎn)品打開的實驗自由化之門，那么跟進的國產(chǎn)產(chǎn)品則實實在在讓國內(nèi)科研經(jīng)費緊張的實驗室也能分享簡化實驗的快樂，窮人的孩子也有春天。在國內(nèi)，價格還是最有殺傷力的。天為時代已經(jīng)被Qiagen收購并改名天根，而在國產(chǎn)品牌中口碑很好的維特潔也被Axygen收購。生物通在這里列舉了部分國產(chǎn)產(chǎn)品的對比，當然，要注意參數(shù)是廠家提供的，標準有差別的。
（待續(xù)，大片斷和小片斷回收攻略/丙烯酰胺凝膠回收）生物通技術(shù)專題文章
續(xù)前：大片段級：指的是片段大小超過10kb的DNA片斷，由于越長的DNA分子和純化膜的結(jié)合力越強，洗脫力越差，在離心過柱時可能被“扯斷”，因此常規(guī)的離心過柱的方法并不適合對付這些大家伙。在凝膠電泳的大片斷回收，特別是幾十kb的大片斷，經(jīng)典方法是生物通前文提到的電洗脫。此外，低熔點瓊脂糖和瓊脂糖酶消化也是常常有人選用的方法，新興的方法是用玻璃奶或者純化填料，生物通在此一并介紹。其實無論用什么方法，在回收大片斷時一定要牢記你對付的是大片斷，操作時一定要小心注意，粗暴的操作，最后結(jié)果也是自己來承受的。
這些方法中，速度最快的就是玻璃奶或者純化填料珠的試劑盒了。畢竟，誰愿意為一個小小的膠回收浪費2個多小時呢？有那功夫干點別的不好？我最早用的其實是當時的Pharmacia（后來改為Amersham，現(xiàn)在是GE Healthcare Life Sciences）的一個玻璃奶（Glassmilk）試劑盒。現(xiàn)在記得Glassmilk的人應該不多了，在當時卻是我們眼中的神奇寶貝——半個多小時就可以完成本來要搞2個多小時的活：溶膠液溶膠后，加入10ul混勻的玻璃奶溶液，混勻靜置吸附后，離心去上清，再清洗1—2次，干燥，最后用洗脫液洗脫，離心取上清即可。
1.QIAEX II
產(chǎn)地：Qiagen
回收范圍：40bp-50kb 推薦指數(shù)： 價格指數(shù)：（150次反應2,106，500包裝4,860，約14元/反應，半價活動開始以來，這個試劑盒的性價比就很高啦） 特點：
使用心得：
這個試劑盒不同于Qiagen其它的膠回收試劑盒，利用的是配合高離液鹽（chaotropic salt）的silica-gel particles，因此QiaEX可以從鹽，瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，染料，蛋白以及核苷酸中無需苯酚抽提或者酒精沉淀即可獲得純化DNA片段。這個試劑盒使用方法和玻璃奶的試劑盒基本一樣，區(qū)別在于玻璃奶是粉碎的玻璃，因此可能存在大小不一、邊緣尖銳等情況，在離心力下，大小不同的碎片的沉降系數(shù)不同而導致在沉淀中分布位置不同，當長片斷一頭粘附在大片斷一頭吸附在小片斷上，離心產(chǎn)生的剪切力就會導致長片斷的斷裂。而QiaEX的純化填料是人工特制的大小均一的球形小珠（Beads），能更好的吸附DNA，也不易產(chǎn)生上述的剪切力問題，使得回收的大片斷DNA更為完整。
無論是玻璃奶還是純化填料，比起過柱的方法，優(yōu)點在于適用于較大范圍的DNA回收，從小片斷到超級大片斷都可以，適用范圍廣；而且每次反應可以根據(jù)估算的待回收DNA的量來放大或者縮小純化試劑的量，比較靈活。比如QIAEX說是150反應（每次5ug），實際上往往可以用200多次或者更多。
但是這個方法的問題有2個，一個是比較麻煩，需要一定操作經(jīng)驗——無論是清洗或者是最后的洗脫，離心后要盡量多取上清而不干擾沉淀，多少有點點難度，特別是最后取洗脫的DNA，要舍得放棄最后那點上清，免得回收產(chǎn)物中混入了純化介質(zhì)，在后面的實驗中得不償失。所以，你可以從此想象，由于每次離心沉淀后沉淀是浸在上清溶液中的，去除始終不徹底，這就注定了這個方法純化的產(chǎn)物純度不如離心高，回收率也不如那么高。你看，QIAEX說這個回收產(chǎn)物可用于酶切、連接、標記和PCR，但是就沒有提到顯微注射芯片分析等更高要求的實驗。另一個問題是干燥的程度如何把握需要一定經(jīng)驗——干過頭了洗脫困難，沒干透就會將酒精帶入后繼實驗（有人向生物通投訴過純化產(chǎn)物測OD得到非常奇怪的讀數(shù)，過去一看操作，果然是沒干透就洗脫的結(jié)果）——要干到沙面雪白而靠管壁的最邊緣還有丁點透明就可以了。當然，這個現(xiàn)象描述起來不著邊際，做過的人就心中了了。洗脫體積通常是20ul。操作要領(lǐng)除了前面提到的問題，就是離心充分，離心后取管子動作輕快，事前調(diào)好加樣槍，取上清要輕，靠壁、放槍緩，動作利索，不要千萬不要來回抽。舍得放棄。
QiaEX相關(guān)參數(shù)：
類似方法的產(chǎn)品還包括Roche的Agarose Gel DNA Extraction Kit
2 Agarose Gel DNA Extraction Kit
產(chǎn)地：Roche-Applied Science 回收范圍：0.4kb—100kb(單核苷酸〉20bp） 推薦指數(shù)： 價格指數(shù)：（100次/1356，每次反應13元左右） 特點：
使用心得：
Roche的膠回收試劑盒原理也是一樣的，可以完成幾乎實驗室有關(guān)DNA膠回收的所有需要，從基因組大片段DNA到單核苷酸，并且在回收率上也有出彩的表現(xiàn)：0.4-9.5kb，大約80%；10-100kb，大約60%；單核苷酸（>20堿基），大約65%
其實，生物通前面提到的純化介質(zhì)的方法在使用中有一些操作的問題，其實改良起來也并不很困難。只要多提供一個單純過濾離心柱，原來的問題看來應該不難解決——直接將混合有純化介質(zhì)的溶膠液加入柱子中過濾離心，吸附了DNA的純化介質(zhì)在膜上，上清徹底離心到管中，不就不用擔心會懸浮沉淀、干沙等等問題了嗎？其實Promega就有這樣的解決方法，不過由于那試劑盒主要目的是純化PCR產(chǎn)物或者酶切反應中的DNA，本身不帶溶膠液，所以我們在這里就不具體介紹了。
這種方法通常需時半小時左右，算是比較快速省事的。畢竟大片斷的操作要格外小心。除了這種方法，生物通在這里再重復介紹一下其他的一些方法。
1. 低熔點瓊脂糖：如果你手頭有Cambrex（原來的FMC，瓊脂糖行業(yè)標準的制定者）的SeaPlaque GTG瓊脂糖，那真是太幸福了。SeaPlaque是世界上第一個低熔點瓊脂糖系列，Cambrex的GTG（遺傳技術(shù)級別）級瓊脂糖特別去除了抑制酶反應的各種雜質(zhì)，可以在瓊脂糖凝膠中進行各種酶切、連接、PCR、轉(zhuǎn)化等等實驗。所以，SeaPlaque GTG凝膠電泳后切下的條帶就可以在65度融化（20-30度凝固），直接進行后繼的酶切連接PCR等等的反應了，當然，前提是你的電泳槽和Buffer要足夠干凈，最好是專用的。這個反應條件實在是足夠溫和，當然不便宜，25克瓊脂糖要1788大元!特別適合分辨200bp—25kb的片斷。其實，也就是大小通用的方法。
如果只是普通的低熔點瓊脂糖也不要緊，切下來的膠塊加入緩沖液65度融化后冷卻到室溫，可以直接用等體積酚抽，也可以用瓊脂糖酶來消化。酚抽時注意不要劇烈振蕩以免損傷大片斷DNA，兩相間的白色物質(zhì)是瓊脂糖，取上清酚氯仿抽提后乙醇沉淀。瓊脂糖酶可以消化融化的瓊脂糖為低聚糖，隨后用酚氯仿抽提后用乙醇沉淀。New England Biolabs的這種酶50單位價格300多，每200mg 1%凝膠用一個單位酶，42度條件下反應。Takara的這種酶100單位260多，同樣體積的凝膠要用2個單位，可以在60度反應，所以也可以用常規(guī)瓊脂糖。只是常規(guī)瓊脂糖在65度挺難融，很費時間。
2. 電洗脫的原理是將含DNA片斷的凝膠放在一個用半透膜隔離的空間中，通過電泳的電流使得DNA離開凝膠進入液相，回收液相后純化沉淀其中的DNA分子。電洗脫主要的麻煩是在透析帶都比較大、兩頭要綁，沒有剛性的袋子使用不方便，中間溶液體積大，膜面積大容易吸附產(chǎn)物。生物通在03年就有文章介紹以色列一家公司出品的GeBA產(chǎn)品，是在離心指管兩邊開窗貼上透析膜，這種管子可用于透析或者電洗脫，由于管子有剛性，內(nèi)容體積固定，膜面積也很小，同時還提供電洗脫時放在電泳槽中的架子，操作起來十分方便，很大程度上解決了這個困擾。電洗脫條件溫和，對瓊脂糖沒有特殊要求，同時還可以用于丙烯酰胺凝膠中的片斷回收或者是蛋白質(zhì)的回收。GeBA的產(chǎn)品基因有限公司有售，此外Merck旗下的Novagen也引進了類似的產(chǎn)品，價格相當。詳細信息參考：從PAGE膠/瓊脂糖凝膠中回收蛋白質(zhì)/RNA/DNA的新工具。
3. 挖槽法。限于個人習慣的一些不入流的小技巧，有時應急（比如定的產(chǎn)品老不到貨時）也可以對付一下。無非就是在條帶前面挖坑，加入緩沖液，繼續(xù)電泳半分鐘，手提紫外觀察，等條帶全“下海”就把坑里的溶液都吸上來。大片斷會遇到的問題通常是出膠慢，上對岸倒快，所以應對就要用2手，一個是在坑里緩沖液中加點什么讓泳動速度降下來（低熔點瓊脂糖就是其中一個方法），要不就在對岸堵上孔徑特小的膜，等這邊條帶全部下水后反向電泳一下，讓被膜阻擋的DNA回頭，離開那膜。然后取溶液純化DNA。這些方法通常在條帶濃，回收率要求不高的時候可以應急，挺磨耐性的，平常還是用Kit的算了。這里提到的老方法，都要特別注意，切膠的刀要干凈鋒利，切口平滑，切得不整齊有時DNA出膠很慢，不知道為什么。我們這里寫寫，算是憶苦思甜好了。（轉(zhuǎn)下頁）
講完大片斷，剩下就是小片斷的回收了。小于100bp的片斷通常在電泳時就比較難觀察分辨，需要用分辨率很高的瓊脂糖或者丙烯酰胺凝膠。比如Cambrex的NuSieve 3:1或者GTG，或者是大名鼎鼎的MetaPhor瓊脂糖。所以實際上對于小片斷，可以分為兩種情況：一個是真的要回收電泳中特別小的片斷，這種情況我們前面有提到，比如Qiagen MinElute系列可以回收70bp以上的片斷；而QIAEX純化介質(zhì)可以回收40bp以上的小片斷，可以根據(jù)情況選擇，生物通在這里不再羅嗦了。另外一種情況是要去除一些小片斷或者是核苷酸、標記物、或者是一些酶切碎片，或者去掉接頭（Linker/Adeptor）或者什么的。其實這時已經(jīng)不需要用電泳來分別，也就算不上膠回收的范圍，不過既然提到了就順手寫寫。
PCR產(chǎn)物回收試劑盒實際上也是一種除去小片斷的試劑盒，通常回收范圍是100bp到10KB之間，也就是說將小于100bp（或者70bp）的引物或者引物二聚體連同其他雜質(zhì)一同去除，操作簡單，只需要將PCR產(chǎn)物加入過濾純化柱中離心，清洗一次，洗脫就可以了，5分鐘搞定，回收率高達95%。PCR后需要酶切時，以前常常為省略跑膠純化的步驟，要在PCR產(chǎn)物中直接酶切，往往導致一些酶切問題，如今用這種PCR產(chǎn)物純化試劑盒就不用電泳，5分鐘OK了。用不著冒險直接酶切——萬一酶切有問題多麻煩呀。通常同一個品牌的PCR產(chǎn)純化試劑盒和膠回收試劑盒的柱子是同樣的柱子，區(qū)別是膠回收試劑盒多一個溶膠液。所以，你可以用膠回收試劑盒做PCR產(chǎn)物純化，溶膠液照加可也，調(diào)pH和鹽濃度而已。
如果需要純化寡核苷酸或者引物，Qiagen的QIAquick Nucleotide Removal Kit是一個好選擇。可以用于純化17-40mer的寡核苷酸小分子，以及40bp-10kb的DNA。用于純化標記反應是不錯的選擇，方法和PCR產(chǎn)物回收試劑盒是一樣的，很方便。除了這種膜吸附的柱子，還有一種凝膠過濾原理的柱子也可以用于分段收集不同大小的產(chǎn)物，那個在建庫等實驗中用的比較多，也有用于純化標記反應中的未標記分子或者核苷酸的。
很小的DNA片斷常常會用PAGE膠電泳。PAGE膠好像還沒有很好的溶解方法，除了我們前面提到的電洗脫，Qiagen還提供一些私人方法，在應急的時候可以嘗試。將切割下來的PAGE條帶沖洗后加入指管中，加入2倍體積的分散緩沖液（0.5M醋酸胺、10mM的醋酸鎂，1mM EDTA， 0.1%SDS，pH8.0）50度保溫30分鐘，離心取上清，避免混入碎膠，加入3倍體積的溶膠液，后面步驟一樣。這樣也可以回收PAGE膠里的片斷。（生物通專稿微安 張迪）
閃膠http://www.603041.com/a/gb2312/yiqi/Lonza/2009/1106/2370.html LONZA 龍沙細胞培養(yǎng)基 1, 治療級無血清間質(zhì)干細胞培養(yǎng)基
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