ELISA技術要點與常見問題分析解答 （北京畢特博生物技術有限責任公司，國內免疫學產(chǎn)品主要供應商之一）
在ELISA實驗前的注意事項
1 仔細閱讀說明書
2 確定試劑盒在有效期內
3 按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）
4 標本制備要規(guī)范，每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內無法實驗者，注意低溫保存
5 準備好所有實驗額外所需物品，如試管、吸頭、移液器、離心機等
6 根據(jù)檢測標本數(shù)量確定所需試劑的量
7 按說明書將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑
DIY夾心法ELISA常見技術指南
8 選擇抗體時最好選擇一個單抗和一個多抗進行配對；若選擇兩個單抗，必須識別不同表位的抗體；最好從同一家公司選擇抗體對。
9 ELISA實驗中為了確定最佳信號和最低背景應將捕獲抗體（0.5-4μg/ml）和檢測抗體（0.25-2μg/ml）在預實驗中進行彼此相抗的滴定。同時，應包括在適當范圍內的標準品的系列稀釋。按試劑說明書常規(guī)提供的范圍進行操作。
10 標準品的配制：對于每種細胞因子應仔細閱讀說明書，注意每批的細節(jié)。在使用細胞因子前，瞬時離心試劑瓶，盡可能多地收回其中的細胞因子。根據(jù)每批說明書中的細節(jié)，將凍干的細胞因子復溶。
11 一般待測抗原標準曲線的線性范圍的可通過將標準品做8次2倍系列稀釋從2000pg/ml 到15pg/ml。可利用標準的ELISA操作流程、放大試劑盒、第三類試劑、或改變酶底物系統(tǒng)可在一定范圍內提高靈敏度。
12 為了優(yōu)化靈敏度，建議過夜孵育標準品和標本。
13 若使用過氧化物酶作為顯色系統(tǒng)，應嚴禁在洗液和稀釋液中加疊氮鈉，疊氮鈉可抑制過氧化物酶的活性。
14 當測定混合液體中的抗原時，如血清，建議在標本稀釋液中加不相干的Ig.
ELISA常見問題及處理對策
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問題
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可能原因
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解決方法
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無顏色
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試劑孵育的時間沒有按說明書操作。
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確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素-HRP使用的時間是否適當。
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不同試劑盒或不同批號的試劑混用。
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重新檢查試劑的標簽，確準所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。
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漏加酶
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檢查操作流程，注意不要漏加
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HRP酶污染了疊氮鈉
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使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉
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標準品有問題（若在標本孔中有信號）
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按說明書檢查標準品的制備使用1瓶新標準品
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某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質
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盡可能用試劑盒內容器,另覓一定要潔凈、可靠
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使用含血清的緩沖液配制/復溶抗體
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重新確認所選用的試劑
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.漏加顯色劑A或B
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加顯色劑后觀察一下液面高度
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試劑配制/使用有誤
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將實驗重做；嚴格按說明書操作，每次配制和使用前看清標簽。
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緩沖液污染
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配制新新鮮的緩沖液
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顯色弱
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超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號。
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檢查產(chǎn)品的有效期
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加入試劑的體積和時間有誤
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確定所使用的每一個試劑的體積正確的和加入的時間是適當?shù)摹?/p>
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試劑、樣品用前未能平衡
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用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右
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縮短孵育時間能使實驗的信號變弱。
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檢查孵育的時間。
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在溫度變化的環(huán)境內孵育酶標板。
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確定孵育的溫度，應避免溫度的變化。
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使用了被污染的試劑
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檢查試劑是否被污染。
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標準品/標本制備方法不規(guī)范
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檢查標準品/標本的制備，標準品應按說明書進行復溶和稀釋。低溫貯存的標本避免反復凍融，嚴禁使用溶血標本。樣品用 NaN3防腐,抑制了酶的反應
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顯色底物制備不規(guī)范
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檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當充分。
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檢測時間不當
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是否在規(guī)定的時間內檢測。
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儀器設定不正確，濾光片不匹配。
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儀器是否設定正確，濾光片的使用等。
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高背景（本底）
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洗滌操作不規(guī)范
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洗板不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)。最好使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。每孔應完全充滿洗滌緩沖液，傾出時應迅速。若使用洗板機，應校準并設定足夠充滿每孔的體積量。板的內側不應接觸設備。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。
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實驗中孵育溫度和時間不適當
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確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當
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酶加量過多
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加酶前驗看移液器調節(jié)量是否準確。檢查稀釋度，若必要進行效價測定。
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封閉不完全
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檢查封閉液的計算量；提高封閉時間。
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標本或標準品中的干擾物質
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做適當?shù)膶φ?/p>
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顯色劑受光照時間較長,或污染
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顯色劑A和B應于使用前10分鐘從冰箱取出
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整批樣品放置時間過長,樣品污染
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樣品應保持新鮮,或低溫保存,防止污染
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緩沖液污染
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制備新鮮的緩沖液
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吸頭重復使用,未洗凈或消毒不完全而用于加酶或顯色劑
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吸頭盡可能一次性使用
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太多的信號：全部的板子變成規(guī)則的藍色
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不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒結合的過氧化物酶仍有殘留。
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最好使用洗板機充分洗滌檢查孔內是否有殘留的洗液或加樣量是否準確。
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底物溶液混合太早并轉成藍色
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應控制底物混合的時機并立即使用
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太多的酶結合物
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檢查稀釋度，必要時進行效價測定
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封板膜或試劑容器被重復使用，導致HRP殘留，使TMB底物產(chǎn)生非特異藍色。
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使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器
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緩沖液中污染金屬或HRP
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制備新鮮緩沖液
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高CV值（CV：coefficient of variation），花板
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操作不慎或洗滌不充分
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按說明書洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述
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出現(xiàn)干板，沒有使用封板膜、封板膜重復使用
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確定每兩步驟間，酶標板應保持濕潤。使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封板膜。
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由于操作失誤或板子質量差（結合不均勻）造成包板不均勻。
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稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時間和試劑加入的方法。
檢查所使用的酶標板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）
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移液器不準確，吸頭重復使用。
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檢查并校準移液器。每次取樣必須換吸頭。回顧標本的加入步驟，確保每次加樣的準確性，保證吸取的液體按所設定的體積吸入和排出，連續(xù)加樣時注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。
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樣品離心處理不全,反應孔內發(fā)生凝血或殘留細胞成分
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標本充分離心, 3000rpm 6分以上，嚴禁使用凝血（溶血）的標本
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緩沖液污染
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制備新鮮的緩沖液
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標準曲線可得到，但兩點之間區(qū)別很差（低或平的曲線）
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酶結合物不足
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檢查稀釋度，必要時進行效價測定
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捕獲抗體沒有很好結合到板上
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檢查所使用的酶標板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）稀釋用的PBS中不要加其它蛋白
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檢測抗體不足
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檢查稀釋度，必要時進行效價測定
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板子顯色不足
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延長底物孵育實驗使用推薦品牌的底物溶液
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操作不慎
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回顧ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。
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標準曲線稀釋度計算有誤
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核查計算的情況，制備新的標準曲線
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標準曲線很好，但是沒有任何期望的陽性信號產(chǎn)生
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在標本中無相應的細胞因子
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使用內參對照重復實驗，重新考慮實驗的相應參數(shù)
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標本基質遮蓋檢測
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將標本至少做1∶2相應的稀釋，或進行系列稀釋觀測它的恢復性
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標準曲線很好，但是標本的判讀值很高
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標本中含的細胞因子水平超過實驗范圍
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將標本做稀釋并再次實驗
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當使用HRP酶結合物時，TMB底物加終止液后顯綠色
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孔中的試劑顯色不充分
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輕輕振蕩板子
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邊緣效應
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工作環(huán)境溫度不均衡
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避免將板子在變化溫度環(huán)境中孵育
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漂移
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實驗過程中出現(xiàn)間斷
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整個實驗應連續(xù)操作：在實驗開始前將所有標準品和標本做適當?shù)臏蕚?/p>
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試劑沒有按說明書平衡至室溫
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在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說明書中有另外的要求。
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是否可更改試劑盒 所提供的實驗操作步驟？
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一般廠商為確保最高的靈敏度和特異性，對試劑盒都進行了優(yōu)化，為確保每一試劑盒實驗的規(guī)范性應按說明書操作。
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是否可混用不同試劑盒中的試劑？
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不行。絕大多數(shù)試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問題可與廠家或代理商聯(lián)系。
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是否可增加或減少標本的體積。
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商品化的試劑盒所需加入的標本體積是優(yōu)化的，應按說明書操作，不建議更改所加標本的體積。
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是否可重確定自己的標準曲線的點？
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可以。說明書上有建議的制備標準曲線時標準品的稀釋度，可改變稀釋倍數(shù)和增加曲線的點，但是必須在實驗范圍內，高于試劑盒中最高標準品的點和低于靈敏度以下的點是無效的。
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