【摘要】 目的：確定甘氨酰谷氨酰胺細菌內毒素鱟試驗檢查法的可行性。方法：供試品干擾試驗后，采用凝膠鱟試驗對樣品中的細菌內毒素進行檢測。結果：三批樣品稀釋至20 mg/mL、10 mg/mL時，對細菌內毒素的檢測均無干擾作用，樣品中細菌內毒素的含量均小于0.025 EU/mg。結論：所建立方法檢查甘氨酰谷氨酰胺的細菌內毒素可行。
【關鍵詞】 甘氨酰谷氨酰胺；細菌內毒素；鱟試驗；干擾試驗
細菌內毒素檢查是藥品一個非常重要的安全指標。特別對注射用原料藥和注射用制劑藥。近年來，世界各國越來越多地以細菌內毒素檢查法檢查藥品和生物制品中致熱物質來代替兔法進行熱原檢查。甘氨酰谷氨酰胺（GlycylGlutamine）溶解度大，進入人體內迅速水解為甘氨酸和谷氨酰胺而發揮作用。谷氨酰胺是人體內的一種條件必需氨基酸。臨床上谷氨酰胺、酪氨酸與支鏈氨基酸以二肽形式應用于急性胰腺炎、肝、腎、骨骼肌患者的相應氨基酸供應，如復方氨基酸（15）雙肽注射液。《中國藥典》2005年版尚未收載該品種。我們對3批樣品進行了細菌內毒素檢測，以考察該方法的可行性。
1 藥品與試劑
甘氨酰谷氨酰胺（四川思達康藥業有限公司，批號：050701、050702、050703）；細菌內毒素標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：20042）；細菌內毒素檢查用水（湛江安度斯生物制品有限公司，批號：0504300）；鱟試劑（湛江安度斯生物制品有限公司，λ=0.25 EU/mL,批號：0510311），鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，λ=0.25 EU/mL，批號：0602072）。
2 方法與結果
2.1 鱟試劑靈敏度的復核
照文獻［1］附錄規定的方法，對實驗所用的鱟試劑（TAL）進行靈敏度復核。結果鱟試劑的實測靈敏度均在0.5～2.0 λ之間，符合規定。正式實驗時取λ作為鱟試劑的靈敏度［2］。
2.2 樣品細菌內毒素限值的確定
參照《中國藥典》確定樣品的細菌內毒素限值（L），L=K/M，K為人用每公斤體重每小時最大可接受的細菌內毒素劑量，非放射性藥品靜脈途徑給藥時K值為5 EU/(kg·h)，M為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，以mg/(kg·h)表示，人均體重按60 kg計算，甘氨酰谷氨酰胺現在臨床最大用量約為50 mg/kg。L值應為6 EU/mg。參照《中國藥典》2005年版二部甘氨酸原料細菌內毒素的限度值（0.02 EU/mg）［1］和臨床用量，根據生產控制從嚴的實際情況，綜合生產、臨床用藥和檢驗的實際情況，將甘氨酰谷氨酰胺的L值定為0.025 EU/mg。2.3 樣品的干擾試驗
確定最大有效稀釋倍數（MVD），照文獻［1］附錄規定樣品為原料藥，MVD取1，可計算樣品的最小有效稀釋濃度c=λ/L，用λ=0.25 EU/mL鱟試劑進行干擾試驗時，即樣品最小稀釋濃度為10 mg/mL，將樣品稀釋至40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL濃度。取“2.1”項下鱟試劑，分別對3批已檢測細菌內毒素不超標的樣品，進行細菌內毒素干擾試驗。樣品在表1所述3種濃度下，對細菌內毒素檢查均無干擾［2］。表1 樣品的干擾預試驗(略)
參照文獻［1］取2個廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑，分別對3批樣品濃度為20 mg/mL、10 mg/mL進行細菌內毒素干擾試驗確認，并計算以樣品稀釋液配制的細菌內毒素溶液反應終點濃度的幾何均值（Et）及細菌內毒素檢查用水配制的內毒素溶液反應終點濃度的幾何均值（Es），結果見表2。表2 干擾試驗（略）
通過上述干擾試驗的結果表明，供試品在20 mg/mL、10 mg/mL濃度下，進行干擾試驗時，其Et與相應的Es均在0.5～2.0之間，且Es在0.5～2.0 λ之間，說明供試品在20 mg/mL、10 mg/mL對細菌內毒素檢查均無干擾。
2.4 樣品中細菌內毒素的常規檢查
參照文獻［1］，取上述3批甘氨酰谷氨酰胺稀釋至10 mg/mL后，以λ=0.25 EU/mL的鱟試劑，按常規凝膠法進行細菌內毒素檢查（表3）。結果樣品在10 mg/mL中的細菌內毒素含量均小于0.025 EU/mg，且對鱟試驗檢查無干擾作用。表3 樣品中細菌內毒素的常規檢查（略）
3 討論
凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法，條件是適宜的溫度、pH值及無干擾作用。因此，新藥品種是否可用細菌內毒素檢查法替代兔法熱原檢查，首先要證實是否存在干擾因素，確定該品種在有效濃度范圍內進行細菌內毒素檢查時既可以克服干擾因素，又能客觀地反映其所含細菌內毒素的限值［3］。在確定了甘氨酰谷氨酰胺的細菌內毒素限值為0.025 EU/mg后，取3批樣品，用2個廠家的鱟試劑進行細菌內毒素的干擾試驗。結果表明樣品在20 mg/mL、10 mg/mL對細菌內毒素檢查均無干擾作用。從而證實可以建立該品種的細菌內毒素檢查法，其細菌內毒素限值應小于0.025 EU/mg。
【參考文獻】
［1］中華人民共和國國家藥典委員會. 中國藥典［S］. 二部. 北京: 化學工業出版社, 2005: 附錄70, 8687.
［2］肖貴南, 李瑾翡, 吳招娣. 鱟試驗測定乙酰谷酰胺氯化鈉注射液中的細菌內毒素［J］. 華西藥學雜志, 2006, 21(40): 390391.
［3］肖貴南, 區 璇, 陸惠文, 等. 鹽酸普羅帕酮注射液細菌內毒素的鱟試驗研究［J］. 中國藥理學通報, 2004, 20(2): 226229.
（作者：劉華，黃明，周莉） |
