国产欧美一级_国产一区二区免费视频_奇米影视狠888_在线欧美一区

一、培養基的歷史
體外培養（in vitro culture）包括：組織培養（tissue culture）、細胞培養（cell culture）、器官培養（organ culture）。顧名思義，就是將活體結構成分（如活體組織、活體細胞或者活體器官等）從體內或其寄生體內取出，放在類似于體內生存環境的體外環境中，讓其生長發育的方法。廣義組織培養與體外培養同義。
體外培養已經歷了約一百年的發展歷史，但發展初期進程比較緩慢，沒有引起很多學者的重視。直到上世紀50年代后期，體外培養技術才廣泛應用于生物學研究的各個領域，使這項技術得到飛速發展。現在體外培養已成為細胞工程、基因工程、抗體工程的重要組成部分。
細胞培養指從生物機體取出部分組織分散成單個細胞或直接從機體取出單個細胞，也可把體外培養細胞分散成單個細胞在體外條件下培養，細胞能繼續存活與增殖。培養過程中細胞不再形成組織。
發展與完善細胞培養技術圍繞防止污染、改進培養方法、設計新型培養容器、設計不同的培養液等幾個方面進行。
1885年Roux溫生理鹽水培育雞胚組織；
1903年Jolly，1906年Beebe等發明了蓋片懸滴培養；
1907年Harrison培養蛙胚神經成功，開始創建蓋片凹玻璃懸滴培養法；
　　1910、1912年Carrel采用無菌操作、更新培養基、傳代，完善了懸滴培養法；
　　1924年Maximow采用雙蓋片懸滴培養法；
　　1923年Carral設計創立了卡氏瓶培養法，用此法可根據需要隨時更換培養液，既有利于組織不斷生長，又可以運用不同種類的營養液培養不同的細胞，極大地推動了當時組織培養研究。
Earle等加以改進，使大量細胞能直接生長于玻璃瓶壁上，培養了正常細胞與腫瘤細胞的細胞株。至此大多數研究人員都采用培養瓶培養細胞。
組織培養從二十世紀40年代起迅速發展,在培養容器、培養基和培養技術等方面出現了很多革新。
在培養容器方面, 由簡單的用試管、旋轉管培養，發展到多種培養瓶培養，近年來，塑料瓶、皿、多孔培養板的使用已日趨普遍。
在培養基方面，從50年代初，Parke、Eagle等設計出合成培養基后，從純天然培養基到合成培養基、從雞胚浸出液發展到動物血清（促細胞生長物），直至60年代設計出無血清培養基。
首先反映在設計不同種類的緩沖鹽溶液，以用來培養不同的細胞和洗滌細胞。Earle在1948年設計了含有碳酸氫鈉等鹽類的Earle氏鹽溶液，Hank’s在1949年設計了Hank’s氏鹽溶液。
在培養技術方法方面，革新進展更為迅猛，Earle、Dulbecco等于1943年創建單層細胞培養法，首建長期傳代的L-細胞系。
　　1948年Sanford創建單細胞分離培養法，獲L-細胞純系。
　　1951年Gey首建人腫瘤細胞——Hela細胞系。
1961年Hayflick首建人二倍體細胞系25種，開辟了應用新方向。
　　從50年代末開始，組織培養技術應用進入了一個繁盛的階段，廣泛應用于生物學和醫學研究各個領域。
　　誘變建立遺傳缺陷細胞株、雜交瘤技術制備單抗、發展細胞大量培養技術、利用重組技術構建工程細胞株，已成為生物工程的重要生產手段。
在連續灌注培養工藝方面，美國Ohashi,Ryo等人2001年報道采用2L一次性生物反應器灌注培養雜交瘤細胞生產單克隆抗體，以Becton Dickenson Cell Mab+10%胎牛血清+1％聚醚F-68為培養基，最高活細胞密度超過1×107cells/ml；2001年瑞士Heine, Holger等人用帶超聲細胞分離器(UCS)的連續灌注攪拌罐生物反應器培養鼠雜交瘤細胞生產單克隆抗體，穩態培養時活細胞密度超過2×107cells/ml；2004年德國Thomas等人在1L攪拌罐生物反應器中培養rCHO細胞生產人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖濃度限制的高產率灌注工藝減少有害代謝物，代謝轉向TCA循環增加，活細胞密度保持在(1～2)×107cells/ml。
在流加懸浮培養工藝方面，美國麻省理工Xie Liangzhi等人2000年報道在2L生物反應器中流加培養雜交瘤細胞，通過營養控制降低氨和乳酸的比生成速率，補充培養基包括營養成分、胎牛血清和痕量金屬，最大活細胞密度達到1.7×107cells/mL。
 

九、培養基的品質
1．        外觀
顏色、粉末細度須均勻。
2．        溶解性
培養基完全溶解，可以避免培養基內營養成分的流失。
3．        pH值
哺乳類動物細胞生長需要合適的酸堿度，同時pH值的測定也可以檢查培養基的批間差異。
4．        水分
培養基的營養成份很豐富，利于微生物的滋長，因此水分的含量控制可以延長有效期。
5．        冰點滲透壓
細胞必須生活在合適的滲透壓環境中；同時滲透壓值的測定也可以檢查培養基的批間差異。
6．        菌落總數
粉末培養基不是無菌制劑，培養基本身的營養成分很豐富，容易滋生微生物，因此菌落的控制可以延長有效期
7．        細胞生長試驗
可檢查細胞培養基是否有促生長的能力，以及是否有不利細胞生長的毒素。
8．        細菌內毒素
為滿足生物制品細菌內毒素的控制要求，作為生物制品生產原料的培養基同樣需要細菌內毒素控制。
9．        穩定性
確定產品的儲存、運輸條件，產品的保質期限。
10．        一致性
驗證產品的均一性。
十、常見問題解答
1．        如何選用培養基？
選擇培養基沒有一定標準，有幾點建議可供參考：
（1）        建立某種細胞株所用的培養基應該是培養這種細胞首選的培養基。可以查閱文獻，或在購買細胞株時咨詢。
（2）        本單位慣用的培養基不妨一試，許多培養基可以適合多種細胞。
（3）        根據細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養基。如小鼠細胞株多選1640；進行細胞雜交、基因轉移實驗，可選擇IMDM。
（4）        用多種培養基培養目的細胞，觀察其生長狀態，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據實驗結果選擇最佳培養基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。
2．        選擇便宜的培養基品種成本就低嗎？
（1）        通常，培養基可以適合多種細胞，細胞也可以在不同培養液中生長；例如在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。
（2）        培養基養份不同會導致細胞生長效果不同，病毒或蛋白表達不同，應該選擇效果最好的培養基，考慮生物制品的綜合成本；
（3）        最終目的是追求生物制品的得率——得率高則成本低。
3．        L－谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？
L－谷氨酰胺在細胞培養時是重要的，脫掉氨基后， L－谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源，參與蛋白質的合成和核酸代謝。 但L－谷氨酰胺在溶液中不穩定，在高溫下會分解成吡咯烷酮和羧酸，也有一些毒降解產物如NH4+會不可逆轉地損壞細胞壁。
L-谷氨酰胺在不同溫度、不同pH值條件下的穩定性研究如下。

4．        為什么培養基中可以省去酚紅？
酚紅在培養基中被用來作為pH值的指示劑，研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），為避免固醇類反應，用無酚紅培養基。
5．        在新鮮培養基中添加了血清和抗生素后，有效期是多長？
　　    一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
6．        為什么不要用碳酸氫鈉調pH值？
如圖所示，培養基pH值隨著碳酸氫鈉量的增加，呈拋物線增長，當碳酸氫鈉加到一定量時，pH變化越來越小。而培養基的滲透壓值隨著碳酸氫鈉量的增加，呈直線增長，碳酸氫鈉量越大，滲透壓值越大。
如果為了達到工作pH值僅加入少量的碳酸氫鈉，而忽略滲透壓，一來可能會達不到緩沖效果而引起細胞培養過程中pH值變化較劇烈，二來會使培養基成為低滲溶液，在培養細胞時易造成細胞膨脹破裂；如果為了達到工作pH值而加入大量碳酸氫鈉，一來可能會難以達到期望的pH值，二來會使培養基成為高滲溶液，在培養細胞時易造成細胞萎縮。
生產中最好通過實驗找到合適滲透壓和pH值情況下的碳酸氫鈉加入量。下面是DMEM(HED)和MEM培養基的碳酸氫鈉與pH值、滲透壓的曲線。

7．        細胞生長質量很好，為什么病毒、蛋白表達量沒有提高？
細胞生長質量高是高表達的必要條件。
采用細胞生產的疫苗是體外培養一定量的動物細胞并接種病毒，利用病毒在細胞內增殖，得到預期的病毒抗原，然后制成疫苗。細胞生長質量包括細胞密度和形態，沒有好的細胞生長質量就不可能有高的表達量。
但要注意的是，細胞生長質量好、密度厚度大時候病毒接種量也應該相應增大，表達量才會提高，否則前期的高質量細胞培養就可能浪費了。
同時病毒、蛋白的表達、分泌在一定濃度下可能會飽和，因此如欲獲得高表達，還須研究合適的收液時間和次數。
8．        污染是培養基質量不好引起的嗎？
（1）        培養基不是無菌產品，但有菌落數量控制。
（2）        培養基在使用前通過高壓或過濾滅菌。
（3）        防止污染應該注意以下事項：
A.        從污染的源頭開始
?        確認工作細胞庫是否被污染：用細菌、真菌及支原體無菌試驗來確認并排除。同時要對無菌試驗培養基的靈敏度進行驗證。
?        確認毒種工作種子批是否被污染：用細菌、真菌及支原體無菌試驗來確認并排除。同時要對無菌試驗培養基的靈敏度進行驗證。
?        確認所用培養基及其添加成分（如小牛血清、NaHCO3等）是否被污染：用細菌、真菌及支原體無菌試驗來確認并排除。同時要對無菌試驗培養基的靈敏度進行驗證。實際生產中，可以從配制好的培養液中取少量加入營養瓊脂于恒溫培養箱內培養，48小時即可觀察有無污染。
一些單位在使用血清時候往往不經過過濾除菌處理便直接加入到培養液中，可能帶來污染。
?        其它：高壓滅菌設備、過濾除菌設備均應進行驗證，確保滅菌和除菌效果；前者應在投產前及其后的每6個月進行驗證，后者應在每次除菌前、后進行驗證工作（至少應在除菌后進行一次）。
?        另外，應將有毒區與無毒區嚴格分開，并有各自獨立的空氣凈化系統及孵室，有毒區對無毒區應保持相對負壓，防止病毒對培養細胞（尤其是細胞庫）的污染。
B.        從GMP管理、SOP操作方面加強管理力度
?        每二周（或每周）對無菌操作室及潔凈區域按GMP要求進行檢測
?        人員的GMP管理和無菌操作強化培訓
C.        一些特殊情況
?        細菌的大小從0.1-700μm，為防止細小細菌的污染，過濾除菌應盡量采用0.1μm的濾膜或濾芯。
?        大面積污染時，應對所有設施、用具及操作環境進行徹底消毒。
9．        如何消除組織培養的污染？
　　當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。
　　高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
（1）        在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。
（2）        分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。
（3）        每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。
（4）         確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2－3代。
（5）        在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
（6）        重復步驟4。
（7）        在無抗生素的培養基中培養4－6代，確定污染是否已被消除。

十一、培養基
培養基產品分為細胞培養基、平衡鹽、細菌培養基產品。
（一）        平衡鹽（balanced salt solution，BSS）
1885年Sydney Ringer開發生理鹽水發展而來，由無機鹽、葡萄糖和水組成。平衡鹽通常以其發明者命名，基本平衡鹽溶液都是基于細胞需要鈉、鉀、鈣、鎂和磷酸鹽這5種離子開發而來，只是在離子濃度和鹽的形式上有所區別。
平衡鹽的主要功能是維持細胞內外滲透壓平衡、控制和維持酸堿平衡在生理范圍之內、提供能量和代謝所需的無機離子。平衡鹽培養基可用于配制培養用液基礎液及細胞洗滌液。常用的平衡鹽有：
1．        Dulbecco,s平衡鹽（D-PBS），不含碳酸氫鈉；
2．        Hanks,平衡鹽（HBSS），含碳酸氫鈉少，約0.35mg/L；
3．        Earle,s平衡鹽（EBSS），含碳酸氫鈉多，約2.2mg/L；
4．        PBS平衡鹽，無Ca2+、Mg2+離子。
（二）        細胞培養基
1．        傳統基礎細胞培養基及其改良培養基
基礎細胞培養基通常指基礎合成培養基，主要成分為氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽、輔助物質（核酸降解物、氧化還原劑等）。
據不同細胞和研究目的，選用合適培養基,還可補加新成分。如雜交瘤中常用DMEM加丙酮酸鈉、2-巰基乙醇（相當于胎牛血清可透析組分的作用）。
合成培養基使用時加5-30%血清。
（1）        199細胞培養基及其改良品種
1950年由Morgan等設計，除BSS外，含有53種成分，添加適量的血清后，可廣泛用于多種細胞培養、病毒學、疫苗生產等。
199（HB）細胞培養基，主要應用于Vero細胞、地鼠腎細胞轉瓶培養生產狂犬、乙腦等疫苗，具有高緩沖性能，能夠有效提高病毒滴度。
?        改良199細胞培養基——199（HB）細胞培養基
狂犬疫苗生產實踐證明，199（HB）細胞培養基與傳統199細胞培養基相比，具有以下優勢。
a)        細胞生長形態好
用199（HB）細胞培養基培養的細胞生長速度相對較快，形態良好。

b)        營養液的pH較穩定
用199（HB）細胞培養基配制病毒維持液pH值較穩定，經過3－4天的細胞培養后pH值變化小。
c)        病毒原液滴度高
用199（HB）細胞培養基收獲的病毒原液相對用199培養基收獲的病毒原液平均滴度要高，尤其對二次苗的影響。

（2）        BME細胞培養基
基礎Eagle培養基（Basal Medium Eagle），1955年由Eagle設計，BSS＋12種氨基酸＋谷氨酰胺＋8種維生素。簡單、便于添加，適于各種傳代細胞系和特殊研究用，在此基礎上改良的細胞培養基品種有MEM、DMEM、IMDM等。
（3）        MEM細胞培養基
低限量Eagle培養基（Minimal Essential Medium），1959年修改配方，刪去賴氨酸、生物素，增加氨基酸濃度，適合多種細胞單層生長，是一種最基本、適用范圍最廣的培養基，是一種被廣泛應用的培養基。
需要注意的是，MEM細胞培養基有含Earle's平衡鹽的類型，也有含Hanks'平衡鹽的類型；有高壓滅菌型的，也有過濾除菌型的；還有含非必需氨基酸的類型。生產和科研時，應根據實際情況注意選擇合適的MEM細胞培養基。
另外，因MEM培養基營養成分所限，針對生產之特定細胞培養與表達時，并不一定是使用效果最佳或者最經濟的培養基。
（4）        DMEM細胞培養基及其改良品種
DMEM由Dulbecco改良的Eagle培養基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L）。細胞生長快。附著稍差的腫瘤細胞、克隆培養用高糖效果較好，常用于雜交瘤的骨髓瘤細胞和DNA轉染的轉化細胞培養。例如CHO細胞表達生產乙肝疫苗、CHO細胞表達EPO。
?        改良DMEM細胞培養基——DMEM（HED）細胞培養基
DMEM（HED）細胞培養基，培養CHO細胞生產乙肝疫苗，具有較強細胞維持能力，可增加收液次數，有效提高蛋白表達率。
生產和試驗研究證明，DMEM（HED）細胞培養基在細胞生長和病毒分泌方面均優于使用DMEM細胞培養基。
a)        使用DMEM（HED）細胞培養基細胞貼壁和長滿單層時間明顯快于傳統DMEM細胞培養基，維持2個月細胞未出現脫落現象。
使用DMEM（HED）細胞培養基，在接種后第2天， 80％細胞已伸展并開始分裂增殖，第3天已長成較密單層，細胞貼壁均勻，形態清晰，呈多邊形和梭形，細胞間略有空隙，細胞數為7.5 x 106個／ml。在此后轉瓶培養的60 d內細胞數保持穩定，無明顯增加和減少，無脫落，無明顯形態變化，培養液中HBsAg滴度穩定在1：128～1：512之間。
而使用傳統DMEM細胞培養基，只有30％和40％的細胞伸展，至第4天才長成較密單層，小方瓶與雙層轉瓶結果相同。至30 d 時已長成較厚的復層，并開始大片脫落，細胞數明顯減少，HBsAg滴度降低，最低降到1：32 。此后細胞開始重新貼壁、增殖，至45 d左右部分細胞長成單層，一部分細胞因脫落，至60 d時仍未能長滿轉瓶。

 

（5）        IMDM細胞培養基
IMDM是由Iscove's改良的Eagle培養基，增加了幾種氨基酸和胱氨酸量。可用于雜交瘤細胞培養，以及無血清培養的基礎培養基。
（6）        RPMI-1640細胞培養基
Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，針對淋巴細胞培養設計，BSS＋21種氨基酸＋維生素11種等，廣泛適于許多種正常細胞和腫瘤細胞，也用做懸浮細胞培養。
（7）        Fischer’s細胞培養基
用于白血病微粒細胞培養。
（8）        HamF10、F12細胞培養基
1963年、1969年由Ham設計，含微量元素，可在血清含量低時用，適用于克隆化培養。F10適用于倉鼠、人二倍體細胞，F12適用于CHO細胞。
（9）        DMEM/F12細胞培養基
DMEM和F12細胞培養基按照1:1比例混合效果最佳，營養成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無血清培養基的基礎培養基。
2．        低血清細胞培養基
血清對于在傳統培養基配方中生長和增殖的大多數細胞系來說是必不可少的。大部分的組織培養研究者非常熟悉血清添加物給予基本培養基配方的良好生長支持特征。然而，伴隨血清的使用也帶來了很多的問題。
?        費用因素
生產血清費用高而效率低。小牛血清還必須來源于沒有瘋牛病、口蹄疫和其它高度傳染性疾病的地區。
?        差異
所有的血清都是一種成分不確定的混合物，血清批與批之間的組分存在差異。
?        傳染源
動物血清有可能攜帶傳染源，包括支原體、病毒和有毒物質。任何一種傳染源可能對正在生長的細胞系或者制品帶來風險。
?        法規問題
為了使與傳染源相關的風險減少到最低，存在多個國家間進出口生物材料的國際法規。
為了解決這些問題，清大天一公司開發了多種營養培養基，以最小化和消除與使用動物血清相關的制品安全性問題。
（1）        低血清細胞培養基的原理
通常在用傳統培養基培養細胞時須加入約10％的小牛血清，低血清培養基是在基礎培養基中添加了額外的營養成分，使小牛血清的添加量減少50％到70％，而對于細胞生長、增殖、形態和功能有較小或者沒有影響。
（2）        低血清培養基的優點
?        小牛血清是細胞培養液成本最大的原料，使用低血清培養基明顯地節省培養液成本。
?        減少制品純化損失，提高純化收率，便于分離純化。
?        減少由于不確定蛋白或者其它血清組分帶來干擾和差異的風險。
?        提高制品安全性。
?        批間差減少或影響降低：
a)        血清用量減少可以減少使用批次。
b)        血清用量減少使得批間差的影響減少。
?        細胞在低血清培養基的生長相當或者優于加入10％小牛血清的傳統培養基，沒有觀察到在細胞形態及增殖方面的顯著差異。
（3）        低血清細胞培養基的應用
    VERO細胞、BHK21細胞等細胞在轉瓶、微載體反應器中的培養。
5．        無血清無動物組分細胞培養基
無血清無動物組分細胞培養基意指以該培養基配制的培養液無須添加牛血清即可培養細胞和維持生長收液，且該培養基成分中不含有任何動物來源成分。
在細胞培養生產生物制品過程中無須添加動物來源成分，避免瘋牛病、口蹄疫等傳播進入人體，減少人、獸在使用生物制品時的特異性免疫反應、降低產品成本（如降低培養液成本，簡化下游純化工作及提高產品收獲量等）。采用生物反應器、無血清無動物來源成分培養基進行細胞培養制藥是21世紀生物制藥發展趨勢；美國FDA和美國農業部已經嚴格控制在細胞培養中胎牛血清的使用。
同時，高密度細胞培養并長時間維持細胞密度是高表達率和高產量的關鍵，只能通過無血清懸浮培養技術來實現。
為了獲得足夠的營養成分，無血清無動物組分細胞培養基中氨基酸含量倍增，另外添加了生長因子和/或細胞因子，以及含有個別蛋白或大量蛋白的組分。
無血清無動物組分細胞培養基通常是特定細胞專用培養基，如無血清無動物組分CHO懸浮細胞培養基適用于CHO懸浮細胞。
 

6．        替代天然培養基
培養基中不包含有蛋白、水解產物或未知結構的組分，所有的成分均有已知的化學結構。

（三）        細菌培養基
細菌培養基為肺炎、流腦等細菌培養疫苗生產專用培養基。用于細菌性疫苗大規模生產中細菌體的培養及實驗室中細菌體的研究培養。
目前細菌性疫苗生產廠家及實驗室都使用自行配制的培養基進行細菌體的繁殖培養，由于配制工藝的不同、各種培養基組分來源不同，以及培養基中重要活性添加劑來源的質量不穩定性，導致了細菌體繁殖培養的數量和質量不穩定，批間差較大，結果時好時壞，該結果不僅給培養基使用者增加了成本，還嚴重影響了疫苗生產廠家的產量和質量，延誤科研進程。
 

購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 www.603041.com