| ? | ||||||||||||
|
||||||||||||
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
 |
| 購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 www.603041.com |
基因突變(gene mutation)是遺傳病和腫瘤發生的根本原因，檢測與遺傳病及惡 性腫瘤發生有關的突變基因(mutant gene)是分子生物學，醫學遺傳學及腫瘤學研究 的熱點，它對闡明遺傳病和腫瘤發生的分子生物學基礎及其診斷和早期診斷具有重要 ＼意義，分子生物學技術的發展，尤其是PCR技術的出現及近年來以PCR技術為基礎， 結合傳統技術的突變基因分析方法為人們提供了許多快速、簡便、準確的基因分析途 徑，并取得了令人矚目的成果. 基因突變是癌基因激活，抗癌基因失活及遺傳病發生的根本原因，從廣義的角度 來看，基因突變包括點突變，染色體突變和基因組突變三種形式，只是它仍所涉及的 范圍不同，后兩種基因突變涉及的基因較多，可通過光學顯微鏡分析細胞有絲分裂中 期的染色體而檢出.亦可在間期用標記探針檢出，點突變通常的涉及的范圍較少，它 是腫癌和遺傳病發生的主要分子改變，因此，它是基因分析的主要研究內容.不同類 型的基因突變有不同的檢測途徑，大致方法包括：應用基因探針直接檢測；應用PCR 技術檢測；利用探針技術進行分析。 PCR在突變基因檢測時的應用 利用核酸探針及Southern印跡雜交技術進行基因突變分析時由于諸多限制難以滿 足這際工作的需要，自從PCR技術問世以來，建立于PCR技術基礎上的突變基因檢測技 術發展迅速，它不僅能在短時間內檢出發生突變的基因，而且即使獲得極微量的組織 亦可經PCR擴增而進行中種檢測，加上PCR技術與探針雜交技術，RFLP技術及PCR直接 測序的結合，改換方法得以迅速發展和推廣，大大的促進了遺傳病及腫瘤有關的基因 的研究進展. 一、點突變的PCR直接檢出 (一)用PCR直接檢測缺失: 當基因內缺失時，可用已知的該基因DNA序列在缺失片段的兩側設計一對引物， 然后進行PCR，對其產物行瓊糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外檢測儀下檢測有無特異 性的擴增產物，即可非常容易的判斷待檢稱本中有無DNA片段的缺失. 1.一對引物PCR檢測缺失如果一個基因的DNA序列已經清楚，其缺失部位亦較為固 定，即可根據缺失發生區域的DNA序列在缺失片段的兩側合成一對合適的引物進行PCR， 然后瓊脂糖凝膠電泳及溴乙錠染色，短波紫外燈下觀察有無特異性的擴增片段，該方 法是檢測基因片段缺失最為快速的方法，在實際應用中，為了避光因某些原因引起的 擴增失敗而導致假陰性結果的出現，常在反應體系中加入一對與缺失片段無關的基因 引物，同時加以擴增，以確定無特異性擴增帶并非因反應體系的原因的引起.如在應 用PCR技術進行X地貧Bartα基因胎兒水腫綜合征義基因缺失檢測時，常用一對引物擴 增缺失區域，同時同一對β基因引物擴增β基因的一個片段，然后電泳檢測.若同時 即有α和β基因的特異性擴增產物，則說明α基因的擴增產物則說明模板DNA中有α 基因的缺失，為Bart胎兒水腫綜合征. 2.多對引物的多重PCR檢測缺失：對于某些遺傳病的致病基因來說，其缺失具有明顯的異質性，即在不同患者其缺 失片段有所不同，因而難以用一對缺失部位的引物將所有的缺失檢出，在這種情況 下，我們可設計多對引物檢測該基因的不同外顯子區域，即用同一PCR體系擴增多個 外顯子然后用瓊糖凝膠電泳檢測有無缺失的片段，若某一特異性的擴增產物帶缺如， 則可判定為該片段的缺失，該檢測方法是對已知結構基因有無缺失片段的最快速可行 的檢測途徑，目前已用于多種遺傳病基因缺的檢測.如在DMD/BMD缺失型突變的檢測 中，用23對引物分為三組進行多重PCR可改98%的缺失得以檢出，另外還有人用9對物 進行兩組多重PCR，大約可檢出DMD/BMD92%的缺失型突變. 3.用PCR技術進行雜合性丟失的檢測：有報道，PCR技術尚可用于檢測雜合性丟失可采用PCR-SSCP及PCR定量技術進行檢 測. (二)單個堿量置換的PCR直接檢出 1.直接檢測限制性內切酶切點的變化-PCR產物酶解分析 PCR產物的酶解分析，主要用于檢測可引起酶切位點改變--包括所增加的酶切位 點及原有的酶切點消失的單堿是量置換性點突變.當某一點突變引起DNA片段中酶切位 點發生改變時，則可用酶切位點兩側的引物擴增一含該切點的DNA片段，然后用相應 的內切酶進行處理，電泳檢測，與正常的無改變的段進行對片分析即可確定有無酶切 位點的改變.比如狀細胞貧血的發生即是由一酶切位點的改變的改，正常情況下靶DNA 的擴增產物為294bp，經OxaNI消化后產生191bp和103bp二個片段，但鐮狀細胞貧血的 突變使該切點消失，OxaNI消化后仍為294bp的片段，而雜合子則是有294、191和103 三個片段。用引方法檢測突變快速可簡便，但必須在突變點涉及到限制性內切酶切關 并引起進次復時不能因此方法檢測，因此其應用受到限制，反能檢出點突變的極少一 部分. 2.3'特異PCR，擴增阻滯突變系統及等位特異PCR. 以上三種方法結構是基于以下機理，只是不同作者的采用的名河差別而異. 在PCR擴增時，引物的延伸是從其3'未端開始的，而這種延伸的進行要求引物3'端 的堿基與模板需完全配對，只有這樣引物才能延伸，擴增才得以進行下去而得到預期 的擴增產物，若引物3'端與模板不能配對，則引物的延伸即阻斷，不能得到相對應的 擴增產物，基于以上事實，可利用3'端含突變堿基的引物來檢測靶DNA中有無相應的 突變位點，此即3'特異PCR，擴增阻滯突變系統及等位特異PCR.該反應系統包含兩個 PCR擴增反應，有兩對引物但它們的3'端有差異，一為正常引物，另一為3'端編食突 變的引物，正常引物只與正常模板互解，PCR時擴增相應的產物，而食突變的引物只 與突變的模板附擴增出相應的產物.擴增完成后可直接同瓊脂糖電泳技術檢測分析結 果。利用該系統進行基因突變檢測時不僅能檢出突變的純合子，而且能檢出雜合子個 體，在這種情況下，同一個體的DNA模板利用突變引物和正常引物均能引發擴增反應. 尚可利用多對突變引物和正常引物進行多重3'-特異PCR，可攻DNA分子上的多位點變 化的鑒定準確快速，簡便。 3.PCR直接測序 DNA序列分析是檢測基因突變最直接最可信的方法，它不僅可確定突變的部隊， 而且還可確定突變的性質.PCR直接測序是指對PCR產物進行的直接序列分析，而不是 家傳的測序技術先將DNA待測片段克隆于測序載體上，這不僅大大的簡化了操用步 驟，節省大量的人力和物力，而且可實現自動化操用，加之新的熒光檢測技術的應 用，使測序的效率大大提高. 采用PCR循環直接測序時，應首先將擴增產物轉化為單鏈測序模板，目前常用的 轉化方法為不對稱PCR，即在反應體系中引物濃度的差異來形成單鏈DNA，通常側引物 的濃度為100∶1.當某一引物被耗盡后，另一引物擴增的片段即為單鏈然后即可用于 測序，此外，獲得單鏈DNA還有磁珠俘獲法，外切酶消化法及Genomic amplification with transcript sequeucing法(簡稱GAWTS法).PCR直接測序的最新發展是將雙脫氧 絡子技術與PCR技術相結合進行循環測序，在PCR反應體系中同時將ddNTP加入，并利 用同位素或熒光素標記的引物引導擴增后，得模板的擴增與測序同時進行，其特異在 于使用的模板量小且不需分離單鏈. 應用PCR測序有以下優點: (1)附模板的要求，模板需要量小. (2)方法簡便，操作易于標準化，自動化. (3)測序效率高，準確，在短時間即可完成. 4.PCR-寡核苷酸探針斑點雜交(PCR-ASb) 如果一個基因的突變部位，性質經測序分析已經闡明，即可用該方法直接檢測突 變.該方法的原理即利用人工合成的寡核苷酸片段(一般為19n+)作為探針，與經PCR擴 增獲得的靶DNA進行雜交，在嚴格控制雜交條件的前提下，通過斑點雜交式其它類型 的雜交來檢測PCR產物中有無豐應突變，即探針與靶DNA片段之間只要有一個堿基不相 互配對或錯記，就能檢出. (1)探針，探針一般合成兩個，一個為正常序列，另一含有突變位點，前者與正 常靶DNA完全互解，后地只與突變DNA互補，一般長充為19bt.該探針稱之為等位特異 寡核苷酸探針(allele specific oligo nucleotide probe，ASO探針). (2)雜交類型，PCR技術的出現，從根本上解決了靶DNA的來源問題，使人們能在 很短的時間內獲足夠量的靶DNA，傳統的PCR-ASO技術主要是將PCR，占物固定于雜交 膜上，然用不同的標記探針檢測，亦有將已標記好的探針預先固定于雜交膜上，再使 之與PCR產物結合，檢測有無完全互補的DNA產物. (3)探針的標記，最先應用的標記物為放射性物質有32P，34S，但由于其來源， 半衰期及放射性危害不能普遍應用.PCR技術的引進使可在短時間內獲得足夠量的靶 DNA片段，因而對探針的要求亦有的降低，因非同位素標記的探針亦可獲非常滿意的 結果，它不僅使ASO探針使用起來受加快是簡便，而且無同位素半衰期的限制，操作 亦受安全，適合于臨床應用.目前已用PKU，β地貧雜的基因突變檢測. 二、用PCR技術快速篩查突變基因 前邊所述及的方法均可直接檢出突變部位，而其前提則是突變的性質和部位必須 清楚，但在許多情況下，基因突變的位點不固定，而且性質亦不是非常清楚，因此就 需要用一些快速簡便的篩查方法以確定檢材中有無基因突變，近年來，以PCR技術為 基礎建立起來的突變快速篩查技術已普遍應用于腫癌及遺傳病基因突變的檢測. (一)PCR-單鏈構象多態性(PCR-single-strand conformation polymorphism，SSCP) PCR-SSCP是近年來發展起來的一種分析突變基因的方法，由于該方法對檢測基因 的單個堿量置換和某一片段DNA突變位點的篩查提供了有效而快速的手段，現已廣泛 應用于遺傳及惡性腫癌基因突變的分析. 1.PCR-SSCP的原理 PCR-SSCP于1989年首先報道，該方法的原理是基于序列不同的DNA單鏈片段，其 空間構象亦有所不同，當其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，其泳的位置亦發 生變化而表現出不同序列單鏈其電泳遷頻率的差異，從而據引判斷有無突變存在.對 于一段DNA來說，其單鏈具有特定的空間構象，這種空間構象的形成與該段DNA的堿基 序列有關，當這段DNA發生突變，基堿基序列亦發生相應的變化，空間相象亦隨之改 變，研究發現，不同空間構象的DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時的遷效率有所 不同，這樣對于同一段單鏈DNA來說，這種空間構象的變化及電泳遷移的改變即能說 明其有突變的發生因此，可用經PCR擴增的DNA片段經變性成單鏈然后在中性膠中電 泳，即可檢出有無突變. 2.PCR-SSCP是檢測基因中點突變的一種快速而簡便的方法，可用于多個標本的篩 查，應用時應注意以下問題. (1)敏感性:PCR-SSCP對小于300bp的DNA片段敏感性達90-99%，一般認為隨著DNA 片段的增大，其敏感性亦相應的降低，多數報道認為的檢測的擴增片段以100-200nt 最為敏感，但近來的報道發現，175-345nt范圍內進行PCR-SSCP靈敏度無明顯變化， 亦有人用多重SSCP(multiple SSCP)500nt的單鏈DNA點突變亦可檢出. (2)膠的濃度與厚度，一般濃度為5-6%，需要強調的是丙烯酰胺與雙酰酰胺間的 比例一般為40∶1或70∶1.膠的厚度應小于1mm. (3)甘油濃度:在室溫條件下，在凝膠中加入少量甘油(5%-10%)可獲滿意效果，在 突變應用時應根據實驗來確定，在其它條件都固定時，對比1%、5%、10%的甘油濃度 時的檢測效果，以找出最適應甘油濃度. (4)電泳的濃度一般通過實驗來模索最佳溫度，一般以10-15℃效果較好. 3.PCR-SSCP結果的顯示:傳統的PCR-SSCP電泳結果的顯示需要借助同位素標記， 方法復雜，限帽了其推廣.近年來非同位素方法的發展得SSCP技術得以廣泛應用，避 免了同痊素法清多不便，適合于臨床檢測的要求，非同位法有以下幾種: (1)非同位素標記物摻入法:可同生物素或地高親標記的三磷酸化脫氦核苷酸摻 入，然后因相應的方法顯色，但該方法操作復雜，所需試劑故為昂貴是其缺點. (2)SSCP銀染法，是一種簡便實用的方法經濟，快速，可在1-2小時完成，盡管其 靈敏度故同位素方法低，但可完全滿足檢測要求，該衛開始逐漸取代同位素顯方法. (3)EB染色法，方法，但安全性差(EB為致癌劑)，靈敏度低是其缺點. (4)其它，尚有熒光法標記SSCP高，雖然其高效，靈敏，自動化高，但因期需要 特殊設備，環以推廣.PCR-SSCP的出現及應用，使人們對突變基因的檢測和篩查途徑 大為改觀，該方法膠的檢測出率堿置換點突變，而且標本適用范圍廣，多種類型的突 變(如短核苷酸片段的括小與缺失，等均可檢出，而且還能應RT-PCR-SSCP及mRNA-SS CP進行分析，加上操作及技術條件易于掌握，還可適用大量標本的篩查，因而有廣闊 的應用前景，其缺點在于不能確定突變的部位和性質. (二)，變性梯度膠(DGGE)，恒定變性膠(CGGE)及溫度(TGGE)檢測基因突變. DGGE，CGGE及TGGE三種方法是基于相同的原理而設計的突變檢測方法，它仍均是 根據DNA的解鏈特性而設計.對于同一定序列組成或的DNA片段來說，它具有恒定的解 鏈溫度(Tm)，但若其序列發生改變時，Tm值亦發生改變，在含有變性因素(變性劑， 高溫)的凝膠半進行電泳，當其比鏈解開形成分叉時，電泳遷移的速度就會改變.Tm值 全要取決于DNA的堿基組成，序列中出現單堿基替換時，Tm亦發生改變，電泳遷移率 亦改變，此即DGGE，CDGE及TGGE鑒定突變的技術基礎. 1.變性梯度凝膠電泳(denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE) DGGE是檢測基因突變故為精確的方法，它不僅可檢測單一片段的單點突變，對多 點突變的檢測亦較容易，該方法與PCR技術相結合，使其能非常快速的對大量標本進 行分析. 對于一DNA片段來說，其Tam值與基堿基組或有關，當其堿基組成發生變化時，Tm 值亦改變，因此，對于突變的片段來說，若其在一變性物質線性梯度增加的凝膠上進 行電泳時，隨著變性劑濃度的增加，當這種濃度達一定值時突變的DNA片段發生解鏈 而形成分叉，其電泳遷移速度變慢.因此突變的DNA片段與正常的DNA片段電泳的遷移 位置有差別，研究證明DGGE可檢出任何糞型的單堿基取代，如果將突變型與正常的 DNA片段形成異源雙鏈時，其敏感性大大提高. 2.恒定變性膠電泳(Constant deratarared gel electrophoresis CDGE) CDGE是DGGE基礎上發展起來的基因突變檢測技術，亦是利用突變基因與正?；?片段間Tm值的差異來檢測突變的方法，該方法與DGGE的區別在于聚丙烯酰胺中的含的 變性劑濃度相當于含突變基因片段的Tm值，而且濃度恒定，而不是線性遞增.為了提 高DGGE和CDGE的檢測敏感性，通常在一側引物的5'端設計一含GC的區域(GC-ClampGC 鉗)，避免了DNA的完全解鏈，從而提高了突變的檢出率，可達100%. 3.溫度梯度凝膠電泳(Temperature gradient gel electrophoresis TGGE) 該方法是將PCR擴增的產物量一中性聚丙烯酰胺凝膠上，在一溫度線性梯度上升 的電場中進行電泳，當DNA雙鏈到達其Tm時，雙鏈解開，形成分叉，而影響電泳遷移 率，突變的擴增產物其Tm值與野先型有明顯不同，因而有不同的解鏈區，從而造成電 泳遷移效率的差別，據此可判斷檢材中DNA有無突變. (六)異源雙鏈 在同一擴增體系中，若同時含有正常模板和突變型模板時，隨著PCR的循環進 行，野生型基因片段和突變型片段均可擴增，并形成了異循雙鏈，由于異源雙鏈中配 區的出現，因而其它間構型亦發生改變，這機型上的差別即形成電泳圖譜上的差異， 這種方法適合于較小DNA片段的分析，一般在300bp以下，其敏感性與SSCP相似，該技 術簡便，適用于快速的突變檢出，已用于多種遺傳病基因突變的研究. 除上述的幾種以PCR為基礎的突變檢出技術外，還有錯配堿基化學裂解法，PCR- 產物的RNA酶檢出法及引物競爭法用于基因突變的檢出，尤其是錯配堿基化學裂解和 PCR-RNore裂解對突變的檢測仍是10前廣泛應用的突變檢出技術，化學裂解法以期敏 感性高，檢測片段長而應用更為廣泛. 總之，以PCR技術為基礎建立的基因突變檢測技術有多種，而且各有其優缺點， 但目前較為廣泛應用的為PCR-SSCP，PCR-ASO及PCR循環直接測序，隨著新方法的不斷 出現，將會大大的促進基因突變的研究. |
購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物
www.603041.com |
|
