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生物知識

細胞適應無血清培養基的方法

作者：admin 來源：本站 發布時間： 2011-01-07 16:51　 瀏覽次數：
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1. 直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中。

　　一些類型細胞可直接從包含血清的培養基適應無血清培養基。對于直接適應，接種細胞密度應該:2.5×105~3.5×105細胞/ml。當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml時，傳代培養細胞。當細胞密度在培養4到7天后達到2×106~4×106細胞/ml時，細胞完全適應了無血清培養基。每隔3~5天，當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

2. 連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中，與直接適應相比較，連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。

（1） 以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養物到75％有血清培養基：25％SFM 混合培養基中，傳代培養。

（2） 當細胞密度>5×105細胞/ml時，以2×105到3×105細胞/ml細胞密度，在有血清培養基：SFM為50∶50的混合培養基中傳代培養。

（3） 以2×106到3×106細胞/ml細胞密度，25％有血清培養基和75％ SFM中傳代培養。

（4） 當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養基中傳代培養。

（5） 每隔3到5天，當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

　　建議備份前一次混合培養的培養物，直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養基中進行幾次傳代。

　　在適應過程中，最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質，因而更易于受外界因素的影響。

　　細胞培養適應替代血清：許多細胞利用連續適應方法能很好的適應，用包含FBS的的培養基和包含有替代血清的培養基1∶1（v∶v）的混合培養基培養細胞。通過下列的混合培養基的方式，連續幾代減少當前培養基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養基。每次適應改變血清比例時，傳代細胞2到3 次。

　　培養可以直接從FBS轉換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發生，4允許進行2到3次的傳代，使生長率恢復到以前的水平。



　　特別需要強調的是：配制無血清培養液必須使用高質量的水，如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質含量甚微，也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一。

無血清培養基的優點

1. 可避免血清批次間的質量變動，提高細胞培養和實驗結果的重復性。

2. 避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。

3. 避免血清組分對實驗研究的影響。

4. 有利于體外培養細胞的分化。

5. 可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化。


缺點：

1. 細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養基的保存和應用不如傳統的合成培養基方便。

2. 成本較高。

3. 針對性很強，一種無血清培養基僅適合某一類細胞的培養。

無血清培養基一些配方

1. 神經細胞，干細胞，PC12細胞

成份    終濃度

葡萄糖－－0.6％

谷氨酰胺－2mM

NaHCO3－－3mM

Hepes －－5mM

胰島素－－2.5μg/ml

轉鐵蛋白 －100ng/ml

孕 酮 －－20nM

丁二胺－－60μM

硒酸鈉－－30nM

青霉素－－50mg/ml

鏈霉素－－50mg/ml

最后用DF12添加到100ml即可

2. 各類小鼠胚胎癌細胞系培養基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO3 2.4g

HEPES「1.5M」 10.0ul

硒酸（5*10-6M」 10.0ug

纖粘連蛋白 1ug/cm2「37度作用15－30分鐘）

胰島素 1000.0ug

轉鐵蛋白 5000.0ug

3. NIH3T3小鼠成纖維細胞培養基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

HEPES 15mM

大豆胰酶抑制劑 0.1％

胰島素 10.0ug/ml

轉鐵蛋白 25.0ug/ml

纖粘連蛋白 5.0ug/ml

4. 雜交瘤細胞培養基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO3 1.2g/L

HEPES 15mM

胰島素 5.0ug/ml

氨基乙醇 20.0uM

硒酸 2.5mM

轉鐵蛋白 35.5ug/ml
 

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