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小鼠內毒素中毒性休克模型及其救治藥物 的藥效比較
近幾十年來，對內毒素休克的研究很多，但一直沒有滿意的治療方法，死亡率仍高達65～80%。本實驗以探討內毒素休克的發生機制及比較一些藥物治療為目的。 一 實驗方法 １．粗制內毒素；復制小鼠內毒素中毒性休克模型；測定小鼠內毒素中毒的LD50和LD99。 ２．比較一些抗內毒素中毒性休克的藥物阿托品、地塞米松、復方丹參注射液、地塞米松＋復方丹參注射液合并用藥的中西醫結合療法對模型小鼠休克的療效。 二 試劑 阿托品(鄭州市新鄭制藥廠，批號980301)，地塞米松（廣州市橋制藥廠，批號981209），復方丹參注射液（河南省信陽大別山制藥廠，批號9810081），生理鹽水，營養瓊脂（上海市醫學化驗所試劑廠，批號970403），大腸桿菌K12W1485。 三 器械 注射器（１ml），針頭（4號），小鼠罩，天平及砝碼，小燒杯，滴定管，721型分光光度計（50HZ，220V，上海第三分析儀器廠制造），JY 92-2型超聲波細胞粉碎機。 四 實驗對象 昆明小白鼠（120只） 五 實驗方法 ５．１粗制內毒素[9] 參考文獻[9]的方法加以改進： ５．１．１ McFarland氏標準管的配制：1%BaCl
2 0.3ml+1%H2SO4 9.7ml制成9億個/ml細菌的標準管。 600W），得實驗用粗制的內毒素。 23克），雌雄各半，不同性別小鼠按體重隨機分成6組（第六組為對照組，注射生理鹽水）。每組動物稱重并標記后分別按設計濃度及容積腹腔注射內毒素。記錄給藥時間。 25kg），雌雄各半，隨機平均分為5組，各動物稱重并標記。各組動物分別注射內毒素的LD99劑量。觀察注射后小鼠的反應。
觀察時間 死亡小鼠數目 一組 二組 三組 四組 五組 六組 1 9：15pm 1 0 0 0 0 0 2 11：52pm 0 1 1 0 0 0 3 次日1：00am 0 1 1 0 0 0 4 6：30am 0 1 2 6 5 0 5 7：30am 1 0 0 1 0 0 6 9：00am 0 0 1 0 0 0 7 9：40am 1 0 0 1 0 0 8 12：25pm 0 1 2 0 2 0 9 2：43pm 0 0 1 2 0 0 10 9：24pm 1 1 1 0 2 0 11 次日7：31am 0 2 0 0 0 0 總計 共觀察48小時 4 7 9 10 10 0 藥物 24小時后剩余數目（只） 72小時后剩余數目（只） 1 阿托品 3 2 2 地塞米松 6 2 3 復方丹參注射液 1 1 4 地塞米松+復方丹參注射液 3 0 5 生理鹽水 0 0 內毒素是革蘭陰性菌細胞璧中的脂多糖（LPS）組分，只有當細菌死亡破裂或用人工方法裂解菌體后才釋放。不同革蘭陰性菌感染時，由內毒素引起的毒性作用大致相似，本實驗采用大腸桿菌K12W1485制取的內毒素。當血液中細菌或病灶內細菌釋放大量內毒素入血時[1]，可導致內毒素血癥，嚴重時則形成以微循環衰竭和低血壓為特征的內毒素休克，死亡率極高。其病理生理特征主要為低血壓，血管收縮反應性降低，彌散性血管內凝血(DIC)和多器官功能衰竭。其作用機制為：（1）內毒素引起交感──腎上腺髓質系統興奮，使NE、5-HT增多，致小血管收縮痙攣，微循環障礙。（2）影響線粒體代謝，使自由基產生增多，致細胞膜損傷。（3）激活巨噬細胞和中性粒細胞等活性，引起TNF、IL-1，IL-6等細胞因子的釋放，IL-1和TNF協同誘導血管舒張和白細胞介導的組織壞死，造成器官衰竭和死亡。誘導誘導型NO合成酶的表達，使NO增多。NO既有促炎作用，又能抑制磷酸烯酸丙酮酸生成，尤其是NO 將小鼠注入內毒素的LD99劑量，倘若不進行搶救則小鼠會14小時內全部死亡。而本實驗在注入內毒素LD99劑量后半小時內分別注入阿托品、地塞米松、復方丹參注射液、地塞米松+復方丹參注射液四種搶救藥物及生理鹽水。注射了搶救藥的四組小鼠的存活時間及存活率均明顯高于生理鹽水對照組。其中，注射了阿托品和地塞米松的兩組的存活率相對最高，達25%；注射了復方丹參注射液的一組的存活率為12.5%；而注射地塞米松+復方丹參注射液和生理鹽水的兩組小鼠全部死亡。從上述結果可以看出，在本實驗中選用的幾種搶救藥物均能在不同程度上緩解內毒素的中毒癥狀和提高存活率。 阿托品組的小鼠在注射藥物后中毒癥狀在10分鐘內逐漸得到緩解且存活率相對較高，可能是由于阿托品能被機體迅速吸收，因為阿托品能直接與細胞膜上的受體作用，所以對機體的作用較快，在短時間內就能緩解中毒癥狀。但24小時存活率為37.5%，存活時間不及地塞米松，可見其藥效不及地塞米松持久，要加強藥效可能應在相隔一段時間后再注射，如此反復幾次。阿托品[3][6]是乙酰膽堿等受體的阻斷劑，對抗其擴血管作用，使毛細血管前括約肌收縮關閉，因此回心血量增加，血壓回升。大劑量使用其治療中毒性休克，可解除血管痙攣，改善微循環。 地塞米松組的小鼠在注射藥物后中毒癥狀的緩解不如阿托品組的明顯，存活率與阿托品組相同。可能是由于地塞米松要通過細胞膜進入細胞內，與胞漿受體結合，再由胞漿轉移入核內，與核受體結合形成激素 復方丹參注射液組在注射藥物后的癥狀緩解及存活率均不如上述兩組，但存活時間仍大于14小時。可能由于丹參為中藥制劑，藥效因而比較緩慢且較弱。丹參[2]有活血化淤、改善微循環和抗凝的作用，可明顯升穩血壓、減慢心率、增加尿量。其抗內毒素中毒性休克的機理可能是拮抗LPS；對抗氧自由機對細胞的損害；改善血液流變學異常，抗DIC（彌漫性血管內凝血），從而改善微循環；保護內臟細胞及亞細胞膜，從而拮抗MOF；改善肝細胞線粒體能量代謝，減輕酸中毒。 地塞米松與復方丹參注射液合用組[5]在注射藥物后中毒癥狀有所緩解，效果與地塞米松組相當；24小時存活率為37.5%，與阿托品組相同；但48小時后全部死亡，這個結果與預期結果及參考文獻所述不一致。其原因可能是藥物的劑量不足，搶救不夠及時，以及各種環境因素所造成，具體原因不明。此種中西醫結合治療內毒素中毒性休克的方法還有待進一步研究。 本次實驗中的四組搶救組的小鼠存活率均不高，其原因可能是所注射藥物劑量不足，搶救不夠及時，腹腔注射的藥物吸收慢且少。最主要的可能是小鼠內毒素中毒后嗜睡，厭食，不喝水，以致饑餓缺水而死。 八 結論: 小鼠注射內毒素后會出現一系列中毒癥狀，甚至休克、死亡。內毒素中毒性休克的搶救藥物的藥效強弱為阿托品>地塞米松>復方丹參注射液>地塞米松+復方丹參注射液。阿托品為藥效快的短效藥物，藥效持續時間短；地塞米松為藥效緩慢的長效藥物，藥效持續時間長；復方丹參注射液的藥效緩慢且藥效相對較弱。 1:標 題：內毒素導致休克的作用機制探討4 著 者：段文卓; 宮海民 出 處：中國病理生理雜志 1997.04.15; 13(2): 220 2:標 題：復方丹參注射液對兔內毒素休克的防治作用 著 者：黃青青; 楊鏞; 萬林駿; 蘇美仙; 文士銘 出 處：中國危重病急救醫學 1998.04.10; 10(4): 227-230 3:標 題：阿托品解痙作用的實驗和抗感染性休克作用的探討 著 者：劉樹華 出 處：論文選編·建院三十周年專輯 1981.10; : 130-134 4:標 題：腎上腺皮質激素在感染性休克治療中的應用 著 者：湯錫龍 出 處：安慶醫學 1990; (4): 21-22 5:標 題：參附柴液與地塞米松對犬感染性休克合并DIC療效比較 著 者：劉玉英 6: 著 出 7:著 出 8:著 出 9:著 出處：中西醫結合雜志 1990; (11): 675-676標 題：關于感染性休克病機理的探討:兼述阿托品抗感染性休克的藥理作用 者：黃學博 處：山東醫藥 1989; (11): 54標 題：消炎痛在感染性休克中的作用:動物實驗和臨床初步觀察 者：鄧杏飛 處：中華醫學雜志 1988; (8): 440-443標 題：單用大劑量皮質類固醇或與其它藥合用對膿毒性休克存活率的影響 者：王濤 處：戰傷參考資料 1986; (2): 34-35：標 題：白藜蘆醇甘對大鼠內毒素休克的影響 者：張曼 金麗娟 金春華 處：中國病理生理雜志 1997，13（3）：245
５．１．２營養瓊脂按4g/100ml蒸餾水混勻，置于燒瓶中，放置20分鐘，加熱溶化，分裝入高壓容器中高壓滅菌（101Kpa）15分鐘，無菌狀態下注入玻璃平皿中，冷卻，制成平板。將斜面低溫保存的K12W1485大腸桿菌接種到平皿上，劃勻，于37度恒溫箱中培養24小時。用生理鹽水沖洗生長的細菌，制成細菌懸液。用濃度標準比濁和721型分光度計測光密度值，雙重檢測細菌濃度，測定結果為100億個菌/毫升。將懸液于沸水煮沸15分鐘，反復凍融3次。經初試效果稍差，進一步改用超聲粉碎機粉碎細菌（500HZ，T：5min，工作時間：90s，間隙時間：5s，總定時次數：18次，W：500 ５．２測定內毒素的LD50及LD99 ５．２．１預試：取12只小鼠（14 至26克，雌雄各半），不同性別小鼠按體重隨機分為三個劑量組，劑量比為1：3：9。每組分別給藥3.3ml/kg,10ml/kg,30ml/kg。給藥后觀察小鼠出現扭體反射(與死亡正相關)的情況，觀察時間為3小時。 預試結果：3.3ml/kg組4只都沒出現扭體反射，10ml/kg組4只都沒出現扭體反射，30ml/kg組4只都出現扭體反射，即預試的小鼠全死劑量（Dmax）為30ml/kg，全不死劑量（Dmin）為10ml/kg。
５．３正式實驗：
５．３．１計算各組劑量 根據預試測出的小鼠全死劑量（Dmax）全不死劑量(Dmin)范圍安排5組劑量。設n為組數，r為公比，根據r=（Dn/Dm）^（n-1）計算各組劑量。取n=5，則r=0.76，各組劑量為30ml/kg、22.8ml/kg、17.3ml/kg、13.1ml/kg、10ml/kg（每毫升細菌數：100億個）。 ５．３．２：配制藥液 ５．３．３：分組及給藥 取小鼠60只（18 ５．３．４：觀察與記錄 記錄觀察時間內動物癥狀，中毒癥狀，及出現時間，死亡表現及死亡時間，計算各組死亡率。 ５．４參數的計算 用Bliss法電子計算機運算小鼠內毒素的LD50、LD99。 ５．５復制小鼠內毒素中毒性休克模型 取小鼠40只（體重15 ５．６救治內毒素中毒性休克藥物的藥效比較。 待上述六組小鼠出現中毒癥狀后，馬上分別注射藥物（腹腔注射）。每組注射藥物如下： 第一組：阿托品（濃度0.5mg/ml，注入0.08 ml/g，分三次完成，每次間隔一小時）；第二組：地塞米松（濃度0.35 mg/ml，注入0.02ml/g）；第三組：復方丹參注射液（濃度1.5 mg/ml，注入0.6ml/只）；第四組：地塞米松+丹參注射液（濃度同上,注入0.2ml+0.4ml,一小時后再注入地塞米松0.2ml）；第五組：（對照組）生理鹽水（0.6ml/只）。 觀察記錄注射藥物后動物的存活數，計算存活率，比較各種藥物的藥效。
六 結果:
作者: 黃慧梅 蘇潔明 趙婭敏 馬滾韶 指導老師:林老師(實驗生理科學) 吳志均(微生物) 諸輝(分子醫學中心) 摘要 關鍵詞 ６．１:內毒素(LPS)的LD50及LD99 小鼠打入內毒素半小時后出現明顯的扭體反射及收腹效應，一至五組出現的數目分別為2、5、6、8、9只。小鼠煩躁不安，氣喘，呼吸困難，呼吸加快，排便增多，繼之出現活動明顯減少，嗜睡，擠成一團。口唇無明顯紫紺。 觀察兩天，小鼠死亡時間及數目見表一。小鼠死亡前翻正反射消失，口唇明顯紫紺，呼吸26次/min──34次/min且逐漸減少，腹瀉，肌張力明顯降低，角膜反射（+），痛覺反射（+）。死亡癥狀為先肌張力降低，抽搐，打顫，然后死亡。 表一：小鼠死亡時間及死亡數目（每組原有小鼠10只）
各組劑量分別為：10ml/kg, 13.1ml/kg, 17.3ml/kg, 22.8ml/kg, 30ml/kg 第四、五組的高濃度組小鼠死亡集中在注射內毒素后8至14小時,低濃度組死亡的時間分散在不同時間段。死亡數按給藥濃度從高到低為10、10、9、7、4，基本符合預期結果。自然死亡率為0。內毒素LD50的具體計算見表二。 LD50= 9.9ml/kg LD95= 23.9ml/kg LD99= 34.4ml/kg ６．２:藥效比較 小鼠注射內毒素后的癥狀與測定LD50時的癥狀相同。注射搶救藥物后，與生理鹽水對照組比，中毒癥狀有明顯緩解，活動能力稍強，且比沒搶救前強，呼吸稍平穩，扭體反射及收腹效應消失。但與中毒前相比，不如中毒前活潑，縮成一團，嗜睡。注射了搶救藥物的小鼠的存活時間明顯長于注射生理鹽水的對照組。生理鹽水對照組小鼠的存活時間為8至14小時，無中毒減輕；搶救組的存活時間為24至72小時及72小時以上。死亡小鼠的癥狀與測定LD50時的相同。具體注射搶救藥物后的小鼠存活時間及存活數目見表三。 表三：注射搶救藥物后小鼠的存活時間及存活數目 實驗動物:小白鼠 給藥方式:腹腔注射 劑量組數:5 每組原有小鼠8只
七 討論: 前 言 |
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