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簡介
細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用，是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。細胞凋亡和細胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象，是維持體內(nèi)細胞數(shù)量動態(tài)平衡的基本措施。
在形態(tài)上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內(nèi)容物并不釋放到細胞外，不會影響其它細胞，因而不引起炎癥反應(yīng)。
在生物化學上，多數(shù)細胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。
三尖杉酯堿對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時，即可誘導HL-60細胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。本實驗用1μg/ml HT在體外誘導培養(yǎng)的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同時也有少數(shù)細胞發(fā)生壞死。
用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細胞。
細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當細胞壞死時，質(zhì)膜不完整，PI就進入細胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著色，凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進入活細胞，因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。
1、試劑：
三尖杉酯堿（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA緩沖液、堿性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；異丙醇；70%乙醇；溴酚藍，蔗糖指示劑。TBE電泳緩沖液，1%瓊脂糖，溴乙錠。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。
2、儀器設(shè)備：
熒光顯微鏡，電泳儀，電泳槽，微量加樣器（1ml，100μl）0.5、1.5ml離心管，載玻片，蓋玻片。
3.實驗材料:
人早幼粒白血病HL-60細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。
1.三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細胞凋亡
（1）實驗前約24小時，接種兩瓶HL-60細胞，標記①、②，每瓶含約6ml培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
（2）實驗前約2.5小時，當細胞密度達到70%，①號瓶加入三尖杉酯堿200μl，使終濃度為1μg/ml，②號瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時。
2.Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細胞
（1）染色：將瓶中的細胞搖勻取200μl于1.5ml的離心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分鐘。
（2）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10μl，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察，區(qū)別三種細胞，并注意三者比例
1、誘導培養(yǎng)HL-60細胞時間要準確；
2、熒光顯微鏡下觀察細胞時，由于熒光易碎滅，觀察時要盡量快
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